线粒体损伤在重症休克中作用及虎杖苷治疗

发布时间：2018-02-21 06:54

本文关键词： 虎杖苷溶酶体膜通透线粒体通透转变孔线粒体保护剂线粒体功能不全急性重症失血性休克　出处：《南方医科大学》2013年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：重症休克患者有很高的死亡率,在输血补液等一般抗休克治疗后生命仍难以纠正。导致重症休克高死亡的原因很复杂,目前仍然不清楚,因此查明导致高死亡率的发病机制对临床上指导重症休克的治疗具有重要的意义。我们的前期实验证实,血管平滑肌细胞(ASMCs) ATP含量下降,激活ATP敏感性钾通道,促使细胞膜超极化和L型钙通道抑制,导致血管对去甲肾上腺素的反应性下降和顽固性低血压。在这种急性重症休克条件下(失血到MAP30mmHg2小时,回输血液2小时),除了微循环障碍带来血管平滑肌细胞(ASMCs)氧气和营养物质供应不足以外,还查明血管平滑肌细胞线粒体损伤带来ATP的合成障碍引起低血管反应性和顽固性低血压。重症休克是一个全身性缺血-再灌注损伤,它导致线粒体器质性损伤可能是急性休克晚期一个体内普遍存在的现象,参与了重症休克难治期(微循环衰竭期)的发生。为了证实以上设想,本研究对重症休克大鼠的血管平滑肌细胞、大脑神经元和肝细胞的线粒体功能进行了系列研究,从线粒体结构、功能、代谢及损伤机制方面查明线粒体功能不全在重症休克发病中的作用。本研究的另一个目的是查明新的线粒体保护剂,并使用线粒体保护剂从实验治疗的角度,确证线粒体损伤在重症休克发生中的作用。白藜芦醇和环孢霉素A是国际公认的线粒体保护剂。白藜芦醇通过螯合氧化反应所需的二价铁抑制氧化应激,又能够抑制线粒体复合物Ⅲ减少氧自由基生成,发挥保护线粒体的作用。和白藜芦醇一样,环孢霉素A通过作用于亲环素D抑制线粒体通透转变孔开放发挥保护线粒体的作用。虎杖苷(Polydatin,PD)的化学名称是白藜芦醇苷(白藜芦醇结合了一个分子的葡萄糖),因此虎杖苷很有可能具有线粒体保护的作用。本研究一方面用三种线粒体保护剂的保护效应进行相互比较,另一方面用三种脏器细胞的变化与全身休克抢救效果相互对照,查明线粒体保护剂对重症休克治疗的重要性,为临床重症休克的治疗提供新途经。第一部分血管平滑肌线粒体功能不全在重症休克中的作用一、重症休克时血管平滑肌细胞发生了线粒体损伤 1.重症休克时血管平滑肌细胞线粒体超微结构损伤：透射电镜结果显示假手术组血管平滑肌细胞线粒体呈现椭圆状,嵴结构完整,但是在休克组线粒体呈圆球状,嵴断裂空泡化,明显肿胀,提示重症休克时血管平滑肌细胞细胞线粒体超微结构损伤。 2.重症休克时血管平滑肌细胞线粒体内膜跨跨膜电位降低：采用JC-1荧光探针流式细胞仪测定线粒体跨膜电位。休克组线粒体去极化的血管平滑肌细胞为80.34±9.01%,明显高于假手术组的13.44±7.73%(P=0.000),提示重症休克时血管平滑肌细胞可能存在线粒体质子泵功能损伤或通透转变孔开放,带来跨膜离子梯度的下降。 3.重症休克时血管平滑肌细胞ATP含量降低：休克组血管平滑肌细胞ATP含量降低到正常水平(假手术组)的17.61±7.87%(P=0.000),提示重症休克时血管平滑肌细胞线粒体功能不全。 4.重症休克时血管平滑肌细胞膜KATP的激活和细胞超极化：休克组血管平滑肌细胞膜KATP电流相对假手术组显著增加,在电压为+80mV时,KATP电流密度由假手术组的7.0±2.2pA/p)F增加到休克组的15.7±7.3pA/pF(P=0.001),提示重症休克时血管平滑肌细胞ATP含量降低。和KATP的变化一样,细胞跨膜电位由假手术组的-31.7±5.3mV增加到休克组的-49.7±5.3mV(P=0.000),显示重症休克时血管平滑肌细胞超极化。 5.重症休克时血管平滑肌细胞过氧化脂质(LPO)含量增加：实验结果显示血管平滑肌细胞过氧化脂质从假手术组的10.01±1.56nmol升高到休克组的15.00±2.23nmol(P=0.000),提示重症休克时血管平滑肌细胞内氧自由基激活。 6.重症休克时血管平滑肌细胞溶酶体膜稳定性降低：采用吖叮橙摄取技术评价溶酶体稳定性。休克组血管平滑肌细胞溶酶体吖叮橙荧光显著低于假手术组,提示重症休克时血管平滑肌细胞溶酶体膜通透。流式细胞仪定量分析结果显示休克组“苍白细胞”(溶酶体受损的细胞)由假手术组的28.27±5.19%增加到51.6±4.8%(P=0.000),提示重症休克时大量的血管平滑肌细胞存在溶酶体损伤。 7.重症休克时血管平滑肌细胞线粒体通透转变孔开放：采用钙黄绿素—氯化钴技术,共聚焦显微镜观察发现休克组血管平滑肌细胞线粒体荧光显著低于假手术组。流式细胞仪分析结果显示血管平滑肌细胞线粒体荧光由假手术组的156.6±11.8降低到休克组的48.8±7.1(P=0.000),提示重症休克时血管平滑肌细胞线粒体通透转变孔开放,可能伴随线粒体结构和功能损伤。综上所述,重症休克通过氧化应激诱导的溶酶体-线粒体轴引起血管平滑肌细胞线粒体损伤。我们查明此时血管平滑肌细胞缺氧,不仅与微循环障碍有关,还可能存在细胞病性缺氧,本质是线粒体损伤,因此保护线粒体可能是重症休克治疗的一个新靶点。二、查明新的线粒体保护剂-虎杖苷对血管平滑肌细胞的保护效应在3种保护剂中,环孢霉素A、白藜芦醇和虎杖苷不同程度地抑制重症休克引起的线粒体肿胀等结构破坏,其中虎杖苷的保护效果最显著,线粒体结构基本恢复正常；在环孢霉素A、白藜芦醇和虎杖苷治疗后,线粒体去极化的血管平滑肌细胞由休克组的80.34±9.01%分别降低到为75.38±18.33%、53.69±17.10%和31.57±6.12%,同时血管平滑肌细胞ATP含量由休克组正常水平的17.61±7.89%分别增加到32.69±5.45%、62.12±11.49%和90.71±7.47%；在3种线粒体保护剂治疗后重症休克激活的KATP得到部分抑制,其中虎杖苷效果最显著,在电压钳制在+80mV时,休克虎杖苷治疗组电流密度由休克组的15.7±7.3pA/pF减少至9.4±4.2pA/pF。和KATP的变化一样,休克虎杖苷治疗组的细胞跨膜电位由休克组的-49.7±5.3mV降低到的-36.9±7.2mV；在3种保护剂治疗后血管平滑肌细胞LPO含量均有下降,其中在休克虎杖苷治疗组下降程度最显著,由休克组的15.00±2.23nmol降低到10.42±0.99nmol(P=0.000);3种线粒体保护剂抑制了重症休克时血管平滑肌细胞溶酶体红色吖叮橙荧光和线粒体绿色钙黄绿素荧光强度减弱,其中虎杖苷作用效果最显著,在环孢霉素A、白藜芦醇和虎杖苷治疗后,“苍白细胞”由休克组的51.63±4.77%,分别减少到42.05±2.81%、47.46±3.06%和36.85±3.84%,同时血管平滑肌细胞线粒体绿色钙黄绿素荧光由休克组48.8±7.1恢复到环孢霉素A治疗组的59.7±13.4,白藜芦醇治疗组的62.3±24.8和虎杖苷治疗组的79.6±8.6。总之,3种线粒体保护剂通过抑制重症休克时氧化应激和随后的溶酶体膜通透及线粒体通透转变孔开放发挥了保护血管平滑肌细胞线粒体的作用,其中虎杖苷作用效果最强,血管平滑肌细胞内的ATP含量增加到正常水平的90.71±7.47%。因此虎杖苷是重症休克治疗中理想的线粒体保护剂。第二部分大鼠多脏器实质细胞线粒体在重症休克中发生的变化重症休克时,血管平滑肌细胞、神经元和肝细胞发生线粒体损伤。1.重症休克时线粒体有类似的形态学改变,即线粒体肿胀,嵴排列紊乱,断裂呈空泡,基质低电子密度,提示重症休克诱导多脏器线粒体结构破坏。2.细胞内ATP含量降低,以血管平滑肌细胞最为显著,ATP含量降低到正常水平的17.61±7.87%,提示重症休克时多脏器线粒体功能不全。3.线粒体跨跨膜电位降低,提示重症休克时多脏器线粒体电子传递链功能不全和线粒体通透转变孔开放。4.有类似的发病过程,即LPO含量和“苍白”细胞增加,线粒体通透转变孔开放,提示氧化应激诱导的溶酶体损伤和随后的线粒体通透转变孔开放参与了重症休克时多脏器线粒体损伤。第三部分线粒体保护剂对重症休克线粒体的保护作用一、线粒体保护剂抑制了重症休克线粒体结构损伤：在线粒体保护剂治疗后,3种细胞(血管平滑肌细胞、神经元和肝细胞)线粒体肿胀减轻,嵴断裂减少,基质电子密度增加,提示线粒体保护剂抑制重症休克诱导的线粒体结构损伤,在虎杖苷治疗组最为显著,线粒体结构基本恢复正常。二、线粒体保护剂抑制重症休克线粒体跨膜电位降低：在3种线粒体保护剂治疗后,线粒体去极化的细胞在血管平滑肌细胞由休克组的80.34±9.01%,分别降低到75.38±18.33%、53.69±17.10%和31.57±6.12%,在神经元由休克组的65.86±10.88%,分别降至59.46±8.23%、56.32±13.70%和26.22±7.73%,在肝细胞分别由休克组的37.21±4.98%分别降至23.09±4.06%、25.12±3.31%和12.49±3.06%,提示线粒体保护剂可能抑制了重症休克诱导的线粒体电子传递链损伤和通透转变孔开放,其中虎杖苷作用效果明显优于环孢霉素A和白藜芦醇。三、线粒体保护剂改善了重症休克线粒体ATP合成功能：在3种线粒体保护剂治疗后,细胞内ATP含量在血管平滑肌细胞由休克组正常水平的17.61±7.89%分别增加到32.69±5.45%、62.12±11.49%和90.71±7.47%,在神经元由正常水平的44.14±13.81%升高到正常水平(假手术组)的54.93±13.79%、63.74±16.06%和89.57±9.21%,在肝细胞由休克组正常水平的48.84±3.84%分别增加地正常水平(假手术组)的63.03±6.81%,57.56±7.08%,87.17±17.29%,提示线粒体保护剂显著改善了重症休克时3种细胞线粒体功能,尤其是虎杖苷,在3种线粒体保护剂治疗组中虎杖苷治疗组具有最佳的ATP含量。四、线粒体保护剂降低了重症休克LPO含量：3种线粒体保护剂治疗后,细胞内的LPO含量过氧化脂质含量出现不同程度的下降,其中休克虎杖苷治疗组下降最显著,在血管平滑肌细胞由休克组正常水平的149.85±22.27%下降到假手术组的104.00±9.89%,在神经元由休克组正常水平的139.93±17.67%降低到正常水平的102.25±9.43%,在肝细胞由正常水平的211.87±21.05%降低到正常水平(假手术组)的102.78±19.61%,提示虎杖苷显著抑制了重症休克诱导的氧化应激和随后的溶酶体和线粒体损伤。五、线粒体保护剂改善了重症休克溶酶体稳态：在环孢霉素A、白藜芦醇和虎杖苷治疗后,“苍白细胞”减少,其中虎杖苷治疗组减少最显著,在血管平滑肌细胞由休克组的51.63±4.77%减少到36.85±3.84%,在神经元由休克组的18.89±2.03%减少到10.12±1.00%,在肝细胞由休克组的30.14±5.73%减少到5.79±1.28%,提示虎杖苷可以显著降低重症休克诱导的溶酶体膜通透。六、线粒体保护剂抑制了重症休克线粒体通透转变孔开放：在线粒体保护剂(环孢霉素A、白藜芦醇和虎杖苷)治疗后,线粒体钙黄绿素荧光出现不同程度的恢复,其中虎杖苷的作用效果最明显,在血管平滑肌细胞细胞由休克组正常水平的31。16±0.05%增加到50.83±5.49%,在神经元由休克组正常水平的60.37±10.06%增加到正常水平的91.32±18.57%,在肝细胞由休克组正常水平的23.68±2.41%恢复到46.69±2.89%,提示虎杖苷有效地抑制了重症休克诱导的线粒体通透转变孔开放。七、线粒体保护剂改善了重症休克的血管反应性、血压：休克大鼠在经输血给药治疗2小时后,休克组去甲肾上腺素阈值增加到失血前的29.3倍,平均动脉压降至47.23±11.28mmHg;在环孢霉素A和白藜芦醇治疗组,去甲肾上腺素阈值分别降至失皿丽的10.4借相11.8倍,同时半均动脉监升至55.23±9.92mmHg和57.10±15.74mmHg；但是在虎杖苷治疗组去甲肾上腺素阈值为失血前的4.8倍,平均动脉压为89.38±16.31mmHg,提示线粒体保护剂不同程度地纠正了重症休克血管低反应性和顽固性低血压,其中虎杖苷的作用效果最显著。八、线粒体保护剂降低重症休克大鼠大脑皮层NADH水平：在输血再灌2小时末,休克组大鼠大脑皮层NADH水平相当失血前增加了38.58±6.52%,提示重症休克大鼠大脑皮层线粒体电子传递链功能障碍。在3种线粒体保护剂中,只有虎杖苷治疗组大脑皮层NADH水平明显降低,降低到15.03±3.06%,提示虎杖苷改善了重症休克大鼠大脑皮层线粒体电子传递链功能。九、线粒体保护剂延长了重症休克大鼠的存活时间：休克组大鼠存活时间仅仅为5.4±2.6h,24小时存活率为0；环孢霉素A和白藜芦醇治疗后,存活时间分别延长了2.05倍和1.95倍,但24小时存活率仍然为0；在虎杖苷治疗组大鼠存活时间延长至休克组的4.35倍,24小时存活率显著提高到5/8,提示虎杖苷显著延长休克大鼠存活时间。综上所述,线粒体保护剂通过抑制重症休克时氧化应激和随后发生的溶酶体膜通透及线粒体通透转变孔开放发挥了保护多脏器线粒体的作用,纠正重症休克顽固性低血压和血管低反应性,延长重症休克大鼠的存活时间,提示采用线粒体保护剂保护多脏器线粒体成为重症休克治疗的新疗法,其中虎杖苷作用效果最显著,休克虎杖苷治疗组大鼠的存活时间由休克组的5.4±2.6h延长到23.7±3.7h,24小时存活率延长到5/8。因此,使用虎杖苷保护线粒体是重症休克治疗的理想选择,为临床重症休克治疗提供了新思路。结论 1.重症休克时血管平滑肌细胞线粒体参与了重症休克顽固性低血压和低血管反应性的发生,最终导致重症休克高死亡率和难治性。 2.查明重症休克时血管平滑肌细胞线粒体损伤与氧化应激诱导的溶酶体-线粒体轴有关。 3.重症休克时不仅存在血管平滑肌细胞线粒体损伤,大脑神经元和肝细胞线粒体损伤也参与了重症休克的发生和发展,提示多脏器线粒体损伤可能是重症休克普遍存在的现象。 4.使用线粒体保护剂可以减轻重症休克时上述线粒体的损伤,在3种检测的药物中,以虎杖苷的保护效应最为明显。据此本文提出重症休克的治疗除了已知的改善微循环措施外,还要针对实质细胞线粒体的新靶点进行治疗,并且找到具有我国自主知识产权的新型的线粒体保护药-虎杖苷。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R459.7

【参考文献】