氢气对重度脓毒症小鼠肠道屏障功能障碍的保护作用及机制研究

发布时间：2018-03-19 06:47

本文选题：氢气　切入点：脓毒症　出处：《天津医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:脓毒症是主要由感染或者高度可疑感染因素引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),是严重创伤、烧伤、重度感染和休克以及重大手术等临床急危重症患者常见的致命性并发症,约半数以上的脓毒症患者病情恶化可继发组织器官损伤并进展为重度脓毒症和脓毒性休克,引起难以纠正的循环衰竭和多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)/多器官功能衰竭(multiple organ failure,MOF),从而导致临床上一半以上脓毒症患者死亡[1,2]。肠道既是脓毒症病程发展过程极易受累的器官之一,也是脓毒症病程进展的动力器官,肠道上皮细胞受损导致的肠道屏障功能障碍在SIRS-脓毒症-MODS的连续发生发展中具有至关重要作用,因此,肠道屏障功能的保护对脓毒症的治疗和预后具有重要的临床意义[3,4]。Rho蛋白及其主要下游效应蛋白Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase,ROCK)和哺乳动物Dia相关成蛋白1(mammalian diaphanous-related formin 1,mDia1)在维持肠道上皮细胞正常细胞形态、极性和细胞间有效连接的功能稳定状态方面发挥着重要作用[5-8],并且在脓毒症发展过程中,Rho蛋白信号通路参与并介导了肠道屏障功能的调控[9]。氢气为近些年研究中新发现的一种新型医学气体,除了具有特征性的选择性抗氧化作用外,还具有抗炎症反应、抗细胞凋亡及细胞信号转导通路调节作用,已经成为脓毒症基础治疗研究的新靶向[10]。本课题组成员初期研究发现,氢气吸入治疗脓毒症具有浓度和时间双重依赖性,2%氢气吸入治疗可明显提高重度脓毒症小鼠的存活率,并减轻肺、肾和肝等重要内脏组织的损伤[11]。本课题拟采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)制备重度脓毒症小鼠模型,观察氢气吸入治疗对脓毒症肠道屏障功能障碍和肠道损伤的具体保护作用并初步探讨Rho-ROCK/mDia信号通路在氢气对脓毒症小鼠肠道组织影响中的关键作用,为氢气应用于临床治疗脓毒症提供坚实的理论基础,为氢气生物学效应的深入研究开辟新的视野。实验一:氢气吸入对重度脓毒症小鼠肠道损伤的保护作用目的:观察氢气吸入治疗对重度脓毒症小鼠存活率和肠道损伤的影响,并从炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等方面阐述氢气吸入治疗对脓毒症肠道损伤的保护作用。方法:成年雄性icr(instituteofcancerresearch)小鼠,6~8周龄,体重20~25g,采用随机数字表法分为以下四个实验组:假手术组、假手术+氢气吸入组(氢气对照组)、重度脓毒症组(模型组)和重度脓毒症+氢气吸入组(氢气治疗组)。采用clp法制备实验动物重度脓毒症模型。氢气吸入方案为:氢气对照组和氢气治疗组小鼠于模型建立后1h和6h分别吸入2%氢气1h。观察制模后7d内动物的存活率。于制模后12h、24h和48h时分别取回肠组织,行he染色,观察肠道组织病理学改变并评分,测定肠道组织中促炎性细胞因子(tnf-α、il-6、hmgb1)和抗炎性细胞因子(il-10)的水平,测定肠道组织髓过氧化物酶(mpo)和抗氧化酶(sod、cat)活性和氧化产物(mda、8-iso-pgf2α)的水平以及细胞凋亡蛋白(activecaspase3)的活性。结果:1.氢气吸入治疗明显提高重度脓毒症小鼠7d内的存活率。2.氢气吸入治疗明显减轻重度脓毒症小鼠制模后不同时间点的肠道组织病理损伤并降低其评分。3.氢气吸入治疗明显降低重度脓毒症小鼠制模后不同时间点肠道组织中tnf-α、il-6和hmgb1等促炎细胞因子、氧化产物mda和8-iso-pgf2α的水平和mpo以及凋亡蛋白activecaspase3的活性,并提高肠道组织中抗炎性细胞因子il-10的水平和抗氧化酶sod和cat的活性。结论:氢气吸入治疗能够有效改善重度脓毒症小鼠的肠道损伤并提高存活率,其对重度脓毒症导致的肠道损伤的保护作用与抑制肠道组织的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等病理过程有关。实验二:氢气吸入对重度脓毒症小鼠肠道上皮细胞功能的影响及机制目的:rho蛋白是细胞内信号转导过程中重要的中间信号分子,rho蛋白及其下游效应蛋白通过调控肠道上皮细胞间紧密连接和粘附连接的稳定状态调节细胞屏障功能和肠粘膜通透性。本实验拟观察氢气吸入治疗对重度脓毒症小鼠肠道屏障功能障碍的改善作用并探讨其对肠道组织rho蛋白信号通路的影响。方法:成年雄性icr小鼠,6~8周龄,体重20~25g,按照随机数字表法分为假手术组、假手术+氢气吸入组(氢气对照组)、重度脓毒症组(模型组)和重度脓毒症+氢气吸入组(氢气治疗组)。采用clp法制备重度脓毒症动物模型并且分别于制模后1h和6h给予氢气对照组和氢气治疗组小鼠吸入2%氢气各1h。于制模后24h时分别进行如下检查测定各组小鼠肠道屏障功能:采用异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐(fitc-右旋糖酐)通过率法检测肠粘膜通透性改变;取血液以及肝脏、脾脏和肾脏等内脏组织匀浆后在细菌培养基上进行细菌培养,检测肠道细菌移位情况;利用透射电镜(tem)观察肠道上皮细胞和细胞间紧密连接和粘附连接等超微结构的形态学改变;采用免疫蛋白印迹(westernblot)法和免疫荧光染色法(immunofluorescence,if)测定小鼠肠道上皮细胞主要紧密连接蛋白和粘附连接蛋白的表达与分布。于制模后24h取回肠组织采用gstpull-down法测定rho蛋白活性,并通过免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,ihc)观察各组小鼠回肠组织中rock1和mdia1的定位和表达情况。结果:1.氢气吸入治疗可明显降低重度脓毒症小鼠制模后24h血清fitc-右旋糖酐的含量和血液、肝脏、脾脏和肾脏组织细菌培养基中菌落形成单位(colony-formingunit,cfu)数目,并明显改善肠道上皮细胞及细胞间连接等超微结构的病理形态改变和肠道上皮细胞紧密连接蛋白和粘附连接蛋白的表达与分布。2.氢气吸入治疗可显著降低重度脓毒症小鼠制模后24h肠道组织中rho蛋白活性和rock1的表达,而明显提高mdia1的表达。结论:氢气吸入治疗可有效改善重度脓毒症小鼠肠道屏障功能障碍,其机制可能为氢气通过调控肠道组织rho蛋白信号通路进而改善肠道上皮细胞间的连接功能。实验三:rho蛋白信号通路在氢气改善重度脓毒症小鼠肠道屏障功能障碍中的作用机制目的:rock和mdia均参与肌动蛋白细胞骨架的重组,在维持肠道上皮细胞的正常形态和极性以及细胞间连接的稳定状态可发挥不同甚至相反的作用[7],本实验拟探讨rho蛋白及其主要下游效应蛋白rock1和mdia1在氢气改善重度脓毒症小鼠肠道屏障功能障碍中的具体作用。方法:成年雄性icr小鼠,6~8周龄,体重20~25g,采用随机数字表法分为重度脓毒症组(模型组)、重度脓毒症+rho蛋白抑制剂组(rho抑制剂组)、重度脓毒症+rock抑制剂组(rock抑制剂组)和重度脓毒症+氢气吸入组(氢气治疗组)。通过clp法制作重度脓毒症模型小鼠。rho抑制剂组和rock抑制剂组小鼠于制模前30min分别经腹腔注射rho活性蛋白抑制剂c3胞外酶100μg/kg和rock特异性抑制剂y-276325mg/kg,模型组和氢气治疗组则于相同时间点接受腹腔注射生理盐水5ml/100g。氢气治疗组小鼠于制模后1h和6h各吸入2%氢气1h行氢气吸入治疗。观察制模后7d内四组小鼠的存活情况并计算存活率。于制模后24h时取回肠组织,分别测定各组小鼠肠道组织中tnf-α、il-6和hmgb1等促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子il-10的水平;测定肠道组织中mpo、抗氧化酶sod、cat和凋亡蛋白activecaspase3的活性;测定肠道组织中氧化产物mda、8-iso-pgf2α的含量。于制模后24h采用fitc-右旋糖酐通过率法检测肠粘膜通透性改变并取血液、肝脏、脾脏和肾脏组织匀浆后进行细菌培养并检测细菌移位情况。于制模后24h时取回肠组织,行he染色观察肠道组织病理学改变并评分,另外通过透射电镜观察肠道上皮细胞和细胞间连接等超微结构的形态学改变;采用westernblot法和免疫荧光染色法检测肠道上皮细胞紧密连接蛋白和粘附连接蛋白的表达与分布。在此基础上,根据实验分组通过westernblot法分别测定肠道组织中rock1和mdia1的表达。结果:1.模型组和rho抑制剂组小鼠7d存活率均为0;rock抑制剂组和氢气吸入治疗组小鼠7d内的存活率明显提高,分别为40%和50%。2.于制模后24h,rock抑制剂和氢气吸入治疗均明显降低重度脓毒症小鼠肠道组织中促炎细胞因子tnf-α、il-6和hmgb1以及氧化产物mda、8-iso-pgf2α的水平,降低mpo和凋亡蛋白activecaspase3的活性,同时提高肠道组织中抗氧化酶sod和cat的活性。此外,氢气治疗组小鼠肠道组织中抗炎性细胞因子il-10的水平明显提高;应用rho抑制剂则对重度脓毒症小鼠肠道组织的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等情况无明显改善作用。3.于制模后24h,rock抑制剂和氢气吸入治疗均可明显降低重度脓毒症小鼠血清fitc-右旋糖酐的含量和血液及内脏组织细菌培养基中菌落形成单位数目,改善肠道组织病理学损伤并降低病理损伤评分,改善肠道上皮细胞及细胞间连接等超微结构的形态学病理改变和肠道上皮细胞紧密连接蛋白和粘附连接蛋白的表达与分布;未见rho抑制剂应用对重度脓毒症小鼠上述肠道屏障功能检测指标的改善作用。4.于制模后24h,rock抑制剂和氢气吸入治疗均可显著降低重度脓毒症小鼠肠道组织rho蛋白活性和rock1的表达并明显提高mdia1的表达;而rho抑制剂组小鼠肠道组织中rock1和mdia1的表达显著下调。结论:氢气吸入治疗通过上调mdia1表达同时下调rock1表达的方式调节rho蛋白信号转导通路,改善重度脓毒症小鼠肠道屏障功能障碍,从而抑制肠道组织炎症反应、氧化应激和细胞凋亡,减轻肠道组织病理损伤,并最终改善脓毒症进程,提高生存率。小结1.2%氢气吸入治疗能够通过调节rho蛋白信号通路改善重度脓毒症小鼠肠道上皮细胞屏障功能障碍,具体机制为氢气通过上调mDia1的表达并下调ROCK1的表达增强肠道上皮细胞间有效连接的稳定性发挥改善重度脓毒症小鼠肠道屏障功能障碍的作用,从而抑制肠道组织炎症反应、氧化应激和细胞凋亡,减轻肠道病理损伤,改善脓毒症病程及预后。2.本研究中,2%氢气吸入在对重度脓毒症小鼠模型的治疗过程中未发现任何毒副作用,在发挥治疗效应的同时具有较高的安全性,具有良好的临床应用前景。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7

【参考文献】