IL-10-hAMSCS局部移植对小鼠创面愈合过程中IL-10、TNF-α、IL-6影响的实验研究

发布时间：2018-03-27 18:42

  本文选题：hAMSCs　切入点：IL-10　出处：《遵义医学院》2017年硕士论文

【摘要】：目的:通过对小鼠皮肤创面组织炎性因子IL-10、TNF-α、IL-6含量变化的检测,探讨IL-10基因修饰的hAMSCs(IL-10-hAMSCs)局部注射移植于小鼠皮肤全层缺损模型后炎症调节的能力及临床转化应用价值。方法:采用含小鼠IL-10基因的慢病毒载体LV5-IL-10及空质粒载体LV5分别转染hAMSCs,72 h后采用ELISA法分别检测上述2种转染细胞和未转染hAMSCs细胞的培养上清液中IL-10的含量。采用40只8周龄C57BL/6小鼠制备全层皮肤缺损模型,随机分为空白组(不制模且不作任何干预的正常小鼠)、PBS移植组(模型组)、hAMSCs移植组(hAMSCs组)、IL-10-hAMSCs移植组(IL-10-hAMSCs组)、空质粒转染的hAMSCs移植组(空质粒-hAMSCs组),每组8只。模型制备采用背部中线2侧各剪取1cm×1cm大小皮肤全层创面的方式进行,随即根据分组不同,于每个创面各边中点距创缘1mm处注射总量100μL PBS悬浮的各组细胞(细胞数为1×106个),模型组注射等量的PBS。分别于移植后1、3、7、14 d收集创面组织样本,并分别采用组织HE染色观察组织炎症细胞浸润情况;ELISA检测IL-10、TNF-α、IL-6因子的含量;实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)检测IL-10、TNF-α、IL-6因子的mRNA相对含量变化情况。实验同时采用CM-Dil标记hAMSCs移植,连同IL-10-hAMSCs移植和空质粒转染的hAMSCs移植,分别对不同组别的移植细胞的体内定植、存活情况进行示踪分析。结果:IL-10慢病毒及空质粒转染的hAMSCs72h后于倒置显微镜下观察可见视野中均高表达绿色荧光,表明感染后转染率高,ELISA法检测培养基、hAMSCs、IL-10-hAMSCs、空质粒-hAMSCs第72h细胞上清液,结果显示hAMSCs、IL-10-hAMSCs、空质粒-hAMSCs组均有分泌IL-10,IL-10-hAMSCs较hAMSCs组与空质粒-hamscs组分泌多,差异具有统计学意义(p0.05)。he结果显示:在显微镜下观察正常小鼠皮肤组织可见上皮完整,无炎性细胞,伴有毛囊且胶原排列有序呈网状;1d时观察模型组、hamscs组、空质粒-hamscs组、il-10-hamscs组创面创缘均可见大量炎性细胞集中浸润,模型组炎症反应最重,坏死组织最多,其次为hamscs组和空质粒-hamscs组,il-10-hamscs组炎症反应程度最轻,坏死组织最少。3d时观察模型组、hamscs组、空质粒-hamscs组、il-10-hamscs组创面创缘均可见大量炎性细胞弥散浸润,对各组进行炎性细胞计数可知,模型组炎性细胞浸润最多,il-10-hamscs组炎性细胞浸润最少,相对其他三组炎性细胞计数具有统计学差异(p0.05);7d时各组炎性细胞均有所减少,模型组炎性细胞浸润最多,il-10-hamscs组炎性细胞浸润最少,差异具有统计学意义(p0.05);14d时hamscs组、空质粒-10-hamscs组及il-10-hamscs组未见明显炎性细胞浸润,模型组仍有少量炎性细胞浸润,差异具有统计学差异(p0.05)。elisa法和qpcr检测小鼠背部创面及创缘组织结果显示il-10含量及mrna相对表达量:结果可见空白组正常小鼠皮肤组织il-10极低,1d、3d模型组、hamscs组、空质粒-hamscs组、il-10-hamscs组含量逐渐增高,3d达到峰值后逐渐下降;1d、3d、7d、14d,il-10-hamscs组il-10含量及mrna相对表达量均高于其他组,差异具有统计学有意义(p0.05),结果提示:il-10-hamscs可以上调il-10的表达;tnf-α含量及mrna相对表达量:1d、3d模型组、hamscs组、空质粒-hamscs组、il-10-hamscs组含量逐渐增高,3d达到峰值后逐渐下降;1d、3d、7d、14d,模型组tnf-α含量及mrna相对表达量均高于其他几组,与其他组比较具有统计学意义(p0.05),il-10-hamscs组tnf-α含量及mrna相对表达量均低于其他几组,比较具有统计学差异(p0.05)。il-6含量及mrna相对表达量:1d、3d、7d、14d,模型组il-6含量及mrna相对表达量均高于其他组,比较具有统计学意义(p0.05),而il-10-hamscs组il-6含量及mrna相对表达量在各时相点均低于其他组,比较具有统计学差异(p0.05)。结果表明il-10-hamscs可下调tnf-α及il-6的表达。以上细胞因子的表达规律及形式均与he染色病理结果基本相呼应。于移植14天后,荧光示踪显示未转染的hamscs、il-10转染的hamscs及空质粒转染的hamscs仍然存活。结论:1.IL-10-hAMSCs体外培养能够高表达和分泌IL-10。2.创面局部移植IL-10-hAMSCs能够通过上调IL-10含量的表达及下调TNF-α及IL-6含量的表达,减轻创面炎症反应程度,有可能对创面的再生愈合具有促进作用
[Abstract]:Objective : To investigate the changes of IL - 10 , TNF - 伪 and IL - 6 in mouse skin wound , and to investigate the effects of IL - 10 gene modified hAMSCs on the changes of IL - 10 , IL - 10 , TNF - 伪 and IL - 6 . IL - 10 - hamstrings group and il - 10 - hamlet group showed significant difference in inflammatory cell infiltration ( p < 0.05 ) . The results suggested that IL - 10 - hamstrings group had minimal inflammatory cell infiltration , and the contents of il - 10 - hamstrings group were significantly higher than those in other groups . The results showed that IL - 10 - hAMSCs could downregulate the expression of IL - 10 and IL - 6 , and reduce the expression of IL - 6 and IL - 6 . Conclusion : IL - 10 - hAMSCs can downregulate the expression of IL - 10 and the expression of IL - 6 .

【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R641

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本文编号：1672758