TLR5-RA在肠粘膜固有层树突状细胞抵御创伤性失血性休克后肠道细菌移位中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-29 07:10

本文选题：创伤性失血性休克　切入点：肠道细菌移位　出处：《浙江大学》2017年博士论文

【摘要】：第一部分创伤性失血性休克致肠道细菌移位的机制探讨背景创伤性失血性休克(THS)诱导的肠道细菌及其毒素移位入侵是导致内毒血症、系统性感染、脓毒症,继而引起多脏器功能衰竭、甚至死亡的重要因素,但其具体机制尚未明确。肠道菌群过度繁殖、肠道粘膜屏障的损伤、宿主免疫功能缺陷是肠道细菌移位的三因素。而关于创伤性失血性休克后上述机制是否参与到肠道细菌移位中尚缺乏一个统一的认识。实验目的本研究拟在小鼠THS模型的基础上,以肠道细菌移位三因素作为切入点,研究THS是否能引起肠道细菌移位及其具体机制。材料与方法本研究将小鼠随机分为假手术组(Sham组)和创伤性失血性休克组(THS组)。Sham组仅接受切开、缝合、结扎等假手术操作,THS组给予创伤并放血至平均动脉压(MAP)在30±5 mmHg水平,90分钟后予以补液复苏。在该过程中监测了MAP及肠道微循环灌注的动态变化。本研究还通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术检测了肠外组织的细菌移位情况,通过16s rRNA测序法检测了肠道菌群的组成,并作了聚类分析、PCA分析、稀释曲线分析等来观察分析THS对肠道菌群的组成、肠道菌种多样性等的影响,并借助HE染色、FITC-Dextran、Ussing Chamber检测了肠道粘膜结构、通透性、电阻的改变。最后通过流式仪及多因子检测试剂盒分析了小鼠THS后全身的免疫状况。结果在本研究中,我们成功地用C57小鼠构建了 THS模型,并在该模型的基础上观察到了肠道细菌主要是赫氏大肠杆菌移位至肠系膜淋巴结(MLN)、肝脏、脾脏,甚至是血液,细菌移位的发生率明显高于Sham组小鼠。进一步分析原因,本研究发现了小鼠在THS后出现了以变形菌门埃希菌属过度繁殖为主的肠道菌群紊乱、菌群组成显著性改变以及肠道菌群多样性下降等改变。此外,肠道粘膜屏障亦显著损伤,出现了皱襞减少、变平、上皮下水肿、大量绒毛短钝、增粗、倒伏及剥脱以至消失等损伤,以及肠道粘膜电阻下降、通透性增加等改变。此外,肠道微循环灌注在THS后始终处于较低的水平。更为重要的是,全身处于免疫抑制状态,以Th1/Th2平衡向Th2漂移、Th17减少、调节性T细胞增多、DC数目下降为主要表现。结论综上,本研究认为,THS会导致肠道细菌移位至MLN、肝脏、脾脏及血液明显增加,以变形菌门埃希菌属的赫氏大肠杆菌为主,这与休克后肠道菌群的紊乱、埃希菌属细菌过度繁殖、菌群多样性下降、肠道粘膜屏障损伤、全身免疫抑制相关。这三大原因很可能在THS后肠道细菌移位中扮演着互相促进的协同作用。而肠道粘膜微循环障碍、供氧不足导致的PH值的下降、缺血再灌注损伤引起的羟基自由基释放的增加可能是导致肠道菌群紊乱、肠道粘膜屏障损伤的重要原因。宿主全身免疫障碍及其产生的具体机制仍是值得深入研究的一部分。第二部分TLR5-RA在肠粘膜固有层树突状细胞抵御创伤性失血性休克后肠道细菌移位中的作用及机制研究背景继发于创伤和失血的严重的系统性感染是创伤性失血性休克(THS)导致死亡的最主要原因之一。特异性表达Toll样受体5(TLR5)的肠道粘膜固有层树突状细胞(LPDCs)被认为是广泛分布于肠道上皮下的一群抗原递呈细胞,其更容易接触到肠道细菌抗原譬如TLR5受体的特异性配体鞭毛蛋白。受到鞭毛蛋白的刺激后,TLR5+ LPDCs能够通过视黄酸的分泌诱导Th1细胞的分化。但是,TLR5+ LPDCs及其通过视黄酸诱导产生的Th1是否参与到THS后的肠道细菌移位中尚不清楚。实验目的本研究的目的是为了观察TLR5+LPDCs在THS后肠道细菌移位中的作用及内在机制。材料与方法野生型小鼠(WT)和TLR5敲除小鼠(TLR5-/-)被随机分入假手术组(Sham组)或者创伤性失血性休克组(THS组)。在给予左侧股骨中段横断性骨折后,小鼠被放血至平均动脉压(MAP)达到30 ±5 mmHg水平,并在90分钟后用乳酸林格液补液复苏,在该过程中监测小鼠MAP和肠道微循环灌注的改变。在生物性发光柠檬酸杆菌(C.R.)灌胃后5小时,取小鼠肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏和门静脉血液,磨成匀浆后的组织和血涂板过夜培养,然后在小动物活体成像仪下观察生物学发光的C.R.菌落并计数。同时,本研究还监测了 THS后肠道的跨膜电阻和通透性的改变。通过流式分选分出肠道粘膜固有层的CDllc和MHC II双阳性的LPDCs,并通过流式检测LPDCs细胞内RA的表达情况及其诱导Thl细胞分化的情况。最后,通过灌胃给予小鼠RA治疗,观察RA能否抑制细菌移位及延长小鼠的生存期。结果本研究发现,在WT小鼠,THS可以导致更多的肠道细菌移位至肝脏、脾脏和血液,而在TLR5-/-小鼠,无论是否发生THS,细菌移位的数量始终较低。而肠道粘膜电阻和肠道通透性等指标提示,肠道机械屏障在THS后发生了损伤性的改变,但WT小鼠和TLR5-/-小鼠之间始终没有差异。此外,两种基因型小鼠的肠道微循环在THS后始终都处于低灌注水平且无差异,而这可能是THS后肠道粘膜损伤的原因。此外,我们发现在肠道粘膜固有层原位,WT小鼠拥有较多的Thl细胞,且在THS后下降,而TLR5-/-小鼠的原位Thl数量始终较低。进一步研究发现,小鼠肠道粘膜固有层来源的CDllc、MHCII双阳性的LPDCs特异性表达TLR5,且其产生RA的能力和体外诱导Th1分化的水平拥有一致的趋势。在WT小鼠,TLR5+ LPDCs在THS后RA的产量和诱导的Th1分化下降,而Tlr5-8-小鼠LPDCs产生RA的水平和诱导Th1分化的能力并不受THS打击的影响。值得注意的是,RA受体拮抗剂LE540可以明显下降WT小鼠来源的LPDCs诱导的Th1的分化。最后,RA灌胃给药能够明显缓解WT小鼠THS后的肠道细菌移位,却不能缓解TLR5-/-小鼠的细菌移位。结论TLR5+LPDCs通过刺激TLR5,介导RA的产生,诱导肠道局部的Th1的分化,从而抵抗肠道细菌移位,但该机制在THS后不再起作用。另一方面,RA治疗可能通过模拟TLR5-RA依赖的LPDCs的免疫功能而缓解肠道细菌移位。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R605.971

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