基于NF-κB通路探讨清热解毒凉血化瘀法联合骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭模型大鼠的作用机制

发布时间：2018-04-03 23:32

  本文选题：全骨髓贴壁法　切入点：NF-κB　出处：《西南医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究目的:采用全骨髓贴壁法筛选大鼠骨髓间充质干细胞,并进行传代培养及鉴定,同时制备急性肝衰竭伴内毒素血症模型大鼠,通过观察清热解毒凉血化瘀中药联合BMSCs移植对模型大鼠肝组织中TNF-α、iNOS的基因转录及肝组织中核因子NF-κB表达的影响来探讨该联合方法对急性肝衰竭时炎症反应的作用机制。研究方法:1.大鼠BMSCs分离、培养及传代筛选:无菌条件下取出大鼠双侧股骨及胫骨,并在超净工作台中冲洗出骨髓,接种于含10%胎牛血清的培养基中,定期换液,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,并对所培养的细胞进行鉴定。2.急性肝衰竭大鼠模型的建立并验证取体重约为180g-200g健康级SD雄性大鼠,硫代乙酞胺(TAA)以400mg/(kg·d)的剂量灌胃,间隔24h后重复给药1次。设置正常组,给予2ml生理盐水灌胃。造模48h后将存活的大鼠采血、取肝,以检测血清肝功指标和血浆内毒素水平,制作肝组织病理切片,镜下观察肝脏结构及炎性细胞浸润情况,对比正常组,以验证造模是否成功。3.急性肝衰竭大鼠实验分组及干预体重约为180g-200g健康级SD雄性大鼠60只,随机分为正常组(A组)、TAA模型组(B组)、TAA+甘草酸苷治疗组(C组)、TAA+中药治疗组(D组)、TAA+BMSCs治疗组(E组)、TAA+BMSCs+中药组治疗组(F组),每组10只。b组、c组、d组、e组、f组给予400mg/kgtaa灌胃,间隔24h后重复给药1次,制备alf大鼠模型。a组给予2ml生理盐水灌胃。第2次灌胃后将bmsc(约1x107个细胞/只)经尾静脉注射到e、f组大鼠体内,a、b、c、d组大鼠经尾静脉注射等体积的用于培养bmsc的培养液,24h后重复尾静脉注射1次。第1次尾静脉注射后立即予以d、f组大鼠茵陈四苓颗粒灌胃;c组予以甘草酸苷灌胃;a组、b组、e组予以等体积蒸馏水灌胃。干预治疗72h后采血、取肝,检测血清肝功指标、血浆内毒素含量;免疫组化法检测肝组织中nf-κb的表达;rt-pcr法检测肝组织tnf-α、inos的基因转录情况。研究结果:1.成功分离出贴壁生长的细胞,经过3次传代筛选后细胞形态逐渐趋向一致,以梭形为主,呈旋涡状、网状或放射状排列。p3代细胞经流式细胞仪鉴定结果显示:cd29、cd44细胞阳性率分别为98.2%和97.9%,而cd34、cd45细胞阳性率分别为12.9%和18.7%,符合骨髓间充质干细胞表面抗原表达的特点。2.急性肝衰竭模型的验证:taa模型组血清ast、alt及血浆内毒素水平较正常组均明显升高,差异有统计学意义(p0.01)。taa模型组肝组织he染色显示:肝索结构大部分被破坏,肝细胞出现片状坏死、凋亡,大量炎症细胞浸润。正常组肝组织he染色:肝组织细胞排列规律,结构规整,细胞形态正常,无炎症细胞浸润。3.急性肝衰竭模型大鼠经干预后的情况:(1)alt、ast及内毒素水平结果显示:采取治疗的4组(c、d、e、f)大鼠血清ast、alt及血浆内毒素水平明显低于模型组(b组),差异有统计学意义(p0.01);但各治疗组与正常组(a组)对比,ast、alt、内毒素水平仍高,差异有统计学意义(p0.01);各治疗组相比较,f组大鼠血清ast、alt及血浆内毒素水平较c、d、e组低,差异有统计学意义(p0.01);c、d、e三组之间比较,差异无统计学意义(p0.05)。(2)rt-pcr结果显示:a组肝组织中有少量tnf-α、inos的基因转录。b、c、d、e、f组与a组相比,tnf-α、inos的基因转录水平明显升高,差异有统计学意义(p0.01)。采取治疗措施的c、d、e、f组大鼠肝组织中tnf-α、inos的基因转录水平均明显低于模型组(b组),差异有统计学意义(p0.01);各治疗组间比较,f组tnf-α、inos的基因转录水平较c、d、e三组低,差异有统计学意义(p0.01);c、d、e三组tnf-α、inos的基因转录水平差异无统计学意义(p0.05)。(3)免疫组化结果显示:a组肝组织有少量细胞的胞质或胞核内可见nf-κb的表达。灌胃taa的其他五组与a组相比较,表达nf-κb的细胞数目明显增多,差异具有显著统计学意义(p0.01)。经干预后,各治疗组(c、d、e、f组)与模型组(b组)相比,nf-κb表达明显降低,差异有统计学意义(p0.01),与a组相比,nf-κb表达仍然很高,差异有统计学意义(p0.01)。各治疗组间比较,f组表达nf-κb的细胞数目较c、d、e组有所减少,差异有统计学意义(p0.05),而c、e、f三组表达nf-κb的细胞数目相近,差异无统计学意义(p0.05)。研究结论:1.采用全骨髓培养法可成功获得较高纯度的bmscs,且该方法简便、快捷、经济,可作为实验室分离提取bmscs的常用方法。2.以400mg/(kg·d)剂量的TAA灌胃,每天1次,共灌胃2天,能够成功建立急性肝衰竭伴内毒素血症大鼠模型。3.肝衰竭时茵陈四苓颗粒、BMSCs移植均能够降低血浆内毒素含量,两者联合效果更明显。4.肝衰竭时陈四苓颗粒、BMSCs移植均能够抑制NF-KB的激活,两者联合效果更明显。5.肝衰竭时茵陈四苓颗粒、BMSCs移植均能够减少炎性因子TNF-α、iNOS生成减少,两者联合效果更明显6.茵陈四苓颗粒联合BMSCs移植能够明显减轻肝衰竭时肝内失控性炎症反应,其机制可能是与减少内毒素的生成及吸收,抑制炎症信号通路NF-KB激活,从而减少其下游炎性因子TNF-α、iNOS生成有关,且两者具有协同作用。
[Abstract]:Objective: To study the method of whole bone marrow adherent screening of rat bone marrow mesenchymal stem cells, and subculture and identification, and preparation of acute liver failure with endotoxemia rat model, through the observation of detoxification of liangxuehuayu decoction combined with BMSCs transplantation on liver tissue in a rat model of TNF- alpha, iNOS gene transcription and liver tissue NF- expression of nuclear factor kappa B to explore the influence mechanism of the combined method of inflammatory reaction in acute liver failure. Methods: 1. BMSCs rats were isolated, cultured and passaged: bilateral femoral and tibial bone of rats were removed under sterile conditions, and flushed out bone marrow in super clean workbench, medium inoculation with 10% fetal bovine serum in the medium was changed regularly, observe the cell morphology and growth under inverted microscope, and the rat model of acute liver failure.2. identification of the cultured cells to establish and verify the weight is about 180g- 200g鍋ュ悍绾�SD闆勬，

本文编号：1707386