益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的调控作用

发布时间：2018-04-04 14:56

本文选题：急性肝衰竭　切入点：脂多糖　出处：《河北医科大学》2014年博士论文

【摘要】：背景：肝衰竭是多种因素（病毒、药物、肝毒性物质、酒精、遗传代谢性疾病等）引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。急性肝衰竭（acute liverfailure, ALF）是其中一种亚型，起病急、死亡率高，发病2周内出现Ⅱ度以上肝性脑病。其发病机制复杂，目前尚不十分清楚。现已明确，肠源性内毒素血症在ALF的疾病进展中发挥着重要作用。内毒素的主要成分为脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），其主要效应细胞是单核巨噬细胞。有学者发现LPS可激活巨噬细胞内Notch信号通路发挥多种生物学功能。目前关于Notch信号通路与炎症关系的研究尚存在争议，尤其是对白介素-10（interleukin-10, IL-10）的影响，有研究显示Notch信号通路可促进IL-10的分泌，但也有研究显示其可抑制IL-10的分泌。此外，最近研究发现LPS激活巨噬细胞Notch信号通路与晚期炎症介质高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1, HMGB1）的分泌有关。HMGB1是内毒素血症中重要的晚期炎症介质，推测HMGB1在ALF的进展中也发挥着举足轻重的作用。目前，临床上应用益生菌辅助治疗肝病患者已取得很好的疗效，其可以通过调节肠道菌群失调，降低肠道内毒素的产生和吸收，减少血液循环中内毒素的含量，从而改善内毒素血症，对受损的肝脏起保护作用。但对其具体的作用机制尚不明确，且缺乏相关研究。肝衰竭死亡率高，虽然肝移植是最有效的治疗方法，但肝源奇缺、费用昂贵的矛盾仍非常突出。因此肝衰竭的预防显得尤为重要。非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是目前仅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因，NAFLD患者比健康人群更易进展为肝衰竭。早期诊断和治疗NAFLD，可在一定程度上预防肝衰竭的发生。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）是NAFLD疾病进展的重要限速步骤，因此NASH的早期诊断已成为肝衰竭的主要防治工作之一。目的：本研究通过腹腔注射D-氨基半乳糖建立小鼠ALF模型，并应用益生菌干预模型小鼠，通过检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase, ALT），天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、IL-10、HMGB1及血浆LPS水平，肝组织内Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白以及巨噬细胞活化标记物CD68的表达，同时行肝组织病理染色，观察益生菌干预后肝组织病理改变，以及LPS、IL-10、HMGB1与Notch信号通路相关指标的表达变化及意义；体外培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，应用LPS和Notch信号通路的特异性阻断剂氮 [氮（3，5-二氟苯乙酰） L 丙氨酰] S 苯基甘氨酸丁酯（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L alanyl)]-S phenylglycinet-butyl ester, DAPT）进行干预，观察细胞上清液IL-10、HMGB1水平和细胞内Notch信号通路相关指标的表达变化，明确Notch信号通路在外源性LPS刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控作用；同时应用正常小鼠血浆、ALF小鼠血浆和益生菌干预小鼠血浆分别刺激小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，观察细胞上清液LPS、IL-10、HMGB1水平和细胞内Notch信号通路相关指标的表达变化，从整体、组织、细胞及分子水平探讨益生菌对于ALF的可能作用机制，为临床应用益生菌预防ALF提供新的理论基础和实验依据。此外，还通过检测NAFLD患者血清中与NAFLD发病密切相关的指标变化，应用统计学方法进行分析处理，建立NASH的无创诊断模型，从而为NASH的早期诊断，也为肝衰竭的预防提供新思路。方法： 1益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的影响健康清洁级6-8周龄雄性BALB/c小鼠30只，体重（18-20）g，由河北医科大学动物实验中心提供。用标准饲料适应性喂养1周，随机分为以下三组：a正常对照组10只：标准饲料喂养；b ALF模型组10只：标准饲料喂养，给予生理盐水（与益生菌干预组剂量相同）灌胃2周，于2周末腹腔注射3.0g/kg的D-氨基半乳糖（以生理盐水溶解，浓度为60mg/ml）；c益生菌干预组10只：标准饲料喂养，给予益生菌（金双歧）900mg/kg/d（生理盐水配成100mg/ml混悬液）灌胃2周，于2周末腹腔注射3.0g/kg的D-氨基半乳糖（以生理盐水溶解，浓度为60mg/ml）。于腹腔注射3.0g/kg D-氨基半乳糖（造模）36小时处死全部小鼠，留取血清、血浆及肝组织。应用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST水平；应用酶联免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法测定血清IL-10、HMGB1水平；鲎试剂盒检查血浆LPS水平；取部分肝组织以10%中性甲醛溶液固定，用于常规苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色；实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerasechain reaction, real time-PCR）法检测小鼠肝组织Jagged1、Notch1和Hes5mRNA的表达；Western Blot法检测小鼠肝组织Jagged1、Notch1、NICD和Hes5蛋白的表达变化；免疫组织化学染色方法检测小鼠肝组织CD68的表达。 2Notch信号通路在脂多糖刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控作用小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种在六孔板中，每孔5×105个细胞，用含10%胎牛血清和90%高糖DMEM培养至70%融合时进行分组干预。正常对照组：常规培养加入DMSO（剂量与LPS+DAPT组相同）培养24小时后，再加入1×PBS缓冲液（剂量与LPS组相同）继续培养30小时；LPS组：常规培养加入DMSO（剂量与LPS+DAPT组相同）培养24小时后，再加入LPS（100ng/ml）继续培养30小时；LPS+DAPT组：常规培养加入DAPT（10μM）培养24小时后[15]，再加入LPS（100ng/ml）继续培养30小时；收取细胞及上清液。ELISA法测定细胞上清液IL-10、HMGB1水平；Real time-PCR法检测RAW264.7细胞Notch1、Hes5mRNA的表达；Western Blot法检测RAW264.7细胞NICD、Hes5蛋白的表达变化。 3益生菌干预小鼠血浆调控巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制将处于对数生长期的RAW264.7细胞接种在六孔板中，每孔5×105个细胞，用含10%胎牛血清和90%高糖DMEM培养至70%融合时进行分组干预。正常小鼠血浆干预组：80%细胞完全培养基（10%胎牛血清+90%高糖DMEM）+20%正常小鼠血浆培养48小时；ALF小鼠血浆干预组：80%细胞完全培养基（10%胎牛血清+90%高糖DMEM）+20%ALF小鼠血浆培养48小时；益生菌干预小鼠血浆干预组：80%细胞完全培养基（10%胎牛血清+90%高糖DMEM）+20%益生菌干预小鼠血浆培养48小时；收取细胞及上清液。ELISA法测定细胞上清液IL-10、HMGB1和LPS水平；Real time-PCR法检测血浆干预RAW264.7细胞Jagged1、Notch1、Hes5mRNA的表达；Western Blot法检测血浆干预RAW264.7细胞Jagged1、Notch1、NICD、Hes5蛋白的表达。 4细胞角蛋白18、天冬氨酸氨基转移酶、血小板、甘油三酯联合预测非酒精性脂肪性肝炎的发生入选患者均需行肝活检，诊断符合中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版），同时排除酒精性脂肪性肝病（5年内乙醇摄入量男性≥40克/天或女性≥20克/天）或过量饮酒（男性乙醇摄入量≥140克/周或女性≥70克/周）；病毒性肝炎；自身免疫性肝病；药物或毒物诱导的肝损害；遗传代谢性疾病（Wilson’s病、血色素沉着症、α1抗胰蛋白酶缺乏症等）；胆道梗阻。根据肝组织病理学检查结果，，将所有纳入的研究对象分为两组，即非-非酒精性脂肪性肝炎组（non-nonalcoholic steatohepatitis, non-NASH）和NASH组。计算患者体重指数、腰臀比；询问是否合并糖尿病、高血压、血脂异常及吸烟习惯；检测血清ALT、AST、总胆红素（total bilirubin,TB）、白蛋白（albumin, ALB）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase, γ-GT）、国际标准化比率（international normalized ratio, INR）、血小板、白细胞（white blood cell,WBC）、肌酐、尿酸（Uric acid, UA）、空腹血糖（fasting glucose, FG）、甘油三酯（triglycerides, TG），胆固醇（total cholesterol, TC）、血红蛋白、超敏反应蛋白（hs-Creactive protein, hs-CRP）和铁蛋白水平；ELISA法测定血清细胞角蛋白18（cytokeratin18, CK18）凋亡片段M30的水平。实验数据以x±ｓ表示，单因素方差分析前进行正态性及方差齐性检验，Least-Significant-Difference法进行组间比较，双侧P0.05为差异有统计学意义，P0.01为有显著统计学意义。相关性分析采用直线相关分析法。应用SPSS13.0统计软件分析实验数据。结果： 1益生菌对急性肝衰竭小鼠Notch信号通路的影响 1.1小鼠的一般情况：正常对照组小鼠精神状态良好，食欲旺盛，对外界刺激或痛觉反应正常；ALF模型组小鼠精神萎靡，进食减少，动作迟缓，对外界刺激反应减弱；益生菌干预组小鼠精神、食欲及对界外刺激反应介于正常对照组与ALF模型组之间。 1.2小鼠生化指标、血清HMGB1、IL-10及血浆LPS水平变化：ALF模型组小鼠血清ALT（848.404±94.828U/L）、AST（911.490±67.652U/L）、HMGB1（101.909±12.428μg/L）、IL-10（4627.884±842.453pg/ml）和血浆LPS（11.801±0.887EU/ml）水平均高于正常对照组（38.994±9.628U/L、55.279±7.499U/L、20.733±5.369μg/L、1064.924±238.455pg/ml、0.578±0.119EU/ml）（P值均0.01）；而益生菌干预组血清ALT（689.891±84.649U/L）、 AST （776.026±61.892U/L）、 HMGB1（82.556±9.719μg/L）、IL-10（3182.596±769.235pg/ml）和血浆LPS（7.396±0.919EU/ml）水平均较ALF模型组明显降低（P值均0.01）。 1.3肝组织病理学变化：光镜下，HE染色可见正常对照组小鼠肝组织内大小一致的肝细胞围绕肝小叶中央静脉呈放射状分布，肝细胞排列整齐，肝索结构完整；ALF模型组小鼠肝组织正常结构被破坏，肝索结构紊乱，可见大面积肝细胞坏死及大量炎性细胞浸润，残存肝细胞肿胀，呈气球样变；益生菌干预组小鼠肝细胞坏死、变性及炎性细胞浸润程度均较ALF模型组改善。 1.4肝组织Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的表达：ALF模型组小鼠肝组织内Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的表达量均较正常对照组明显增加（P值均0.01）；而益生菌干预组上述指标的表达水平均较ALF模型组明显减少，差异有统计学意义（P值均0.01或0.05）。 1.5肝组织CD68蛋白的表达：ALF模型组小鼠肝组织CD68蛋白（0.631±0.067μm2）较正常对照组（0.339±0.071μm2）明显增加（P0.01）；与ALF模型组比较，益生菌干预组CD68蛋白表达量（0.460±0.094μm2）明显减少（P0.01）。 1.6相关性分析小鼠血浆LPS水平与ALT、AST、Jagged1mRNA、Notch1mRNA、Hes5mRNA、Jagged1蛋白、Notch1蛋白、NICD蛋白、Hes5蛋白、血清HMGB1、IL-10水平及肝组织CD68蛋白的表达水平均呈正相关，相关系数分别为r=0.936、0.946、0.947、0.945、0.948、0.894、0.829、0.926、0.907、0.942、0.900、0.973（P值均0.01）。 2Notch信号通路在脂多糖刺激巨噬细胞分泌细胞因子中的调控作用 2.1RAW264.7细胞上清液中HMGB1和IL-10的含量变化：正常对照组细胞上清液中可检测出低水平的HMGB1（0.213±0.046μg/L）和IL-10（59.192±23.304pg/ml）。经LPS刺激后细胞上清液HMGB（17.441±0.634μg/L）和IL-10（315.188±79.133pg/ml）水平均有不同程度的升高（P值均0.01），其中以HMGB1升高为主；应用DAPT进行特异性阻断后，细胞上清液HMGB1（6.218±0.711μg/L）和IL-10（252.060±57.633pg/ml）水平均较LPS刺激组下降明显，以HMGB1下降最为显著，差异有统计学意义（P值0.01或0.05）。 2.2DAPT特异性阻断剂对LPS诱导的RAW264.7细胞Notch1mRNA、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的影响：RAW264.7细胞经LPS刺激后，细胞内Notch1mRNA、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白水平均较正常对照组明显升高（P值均0.01）；加入DAPT特异性阻断剂进行干预后，与LPS刺激组比较，上述指标的表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P值均0.01）。 2.3相关性分析小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞上清液中HMGB1水平与Notch1mRNA、Hes5mRNA、NICD蛋白和Hes5蛋白均呈正相关，相关系数分别为r=0.849、0.933、0.833、0.866（P值均0.01）；细胞上清液中IL-10水平也与Notch1mRNA、Hes5mRNA、NICD蛋白和Hes5蛋白呈正相关，相关系数分别为r=0.798、0.810、0.821、0.834（P值均0.01）。 3益生菌干预小鼠血浆调控巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制 3.1小鼠血浆干预RAW264.7细胞上清液中HMGB1、IL-10和LPS的含量变化：正常小鼠血浆干预组细胞上清液中HMGB1（3.433±0.674μg/L）、IL-10（286.524±33.507pg/ml）和LPS（0.090±0.014EU/ml）水平较低；ALF小鼠血浆干预组细胞上清液中HMGB1（34.691±9.058μg/L）、IL-10（1812.736±185.574pg/ml）和LPS（2.102±0.121EU/ml）水平则较正常小鼠血浆干预组明显升高，差异有统计学意义（P值均0.01）；与ALF小鼠血浆干预组比较，益生菌干预小鼠血浆干预组细胞上清液HMGB1（20.058±2.278μg/L）、IL-10（1338.322±151.339pg/ml）和LPS（1.220±0.069EU/ml）水平均明显下降（P值均0.01）。 3.2小鼠血浆干预RAW264.7细胞内Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的表达变化：RAW264.7细胞经ALF小鼠血浆干预后，细胞内Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白水平均较正常小鼠血浆干预组明显升高（P值均0.01）；加入益生菌干预小鼠血浆后，与ALF小鼠血浆干预组比较，上述指标表达水平显著降低，差异有统计学意义（P值均0.01）。 3.3相关性分析小鼠血浆干预RAW264.7细胞上清液LPS水平与Jagged1mRNA、Notch1mRNA、Hes5mRNA、Jagged1蛋白、Notch1蛋白、NICD蛋白、Hes5蛋白、细胞上清液HMGB1和IL-10水平均呈正相关，相关系数分别为r=0.969、0.911、0.955、0.931、0.889、0.937、0.940、0.913、0.965（P值均0.01）。 4细胞角蛋白18、天冬氨酸氨基转移酶、血小板、甘油三酯联合预测非酒精性脂肪性肝炎的发生 4.1人口学及实验室指标的变化：Non-NASH组和NASH组患者年龄、性别构成比、吸烟习惯、糖尿病、高血压、血脂异常、收缩压、舒张压、血清TB、WBC、血红蛋白、肌酐、INR、FG、TC和铁蛋白水平差异均无统计学意义（均P0.05），而NASH患者BMI、WHR、血清AST、ALT、ALP、γ-GT、UA、hs-CRP、TG和血小板水平均较non-NASH组明显升高，血清ALB水平则明显降低（均P0.05）。 4.2血清CK18片段M30水平及其与肝组织病理学特征的相关性分析： NASH组患者血清CK18片段M30水平（372.9U/L（319.6,431.4））较non-NASH组（248.1U/L（237.5,266.6））明显升高（P0.001）。其与肝组织脂变（r=0.492）、气球样变（r=0.211）、汇管区炎症（r=0.346）和纤维化分级（r=0.407）均成正相关（P0.05或P0.01）。 4.3多变量分析：体重指数、腰臀比、血清AST、ALT、ALP、ALB、γ-GT、UA、hs-CRP、TG、CK-18片段M30及血小板均纳入多变量模型分析。其中ALT、血小板、CK-18片段M30和TG是NASH的预测因素。四个指标的AUROC分别为0.811（95%CI：0.722-0.899）、0.631（95%CI：0.515-0.746）、0.892（95%CI：0.824-0.960）和0.714（95%CI：0.611-0.818）。其中血清CK-18片段M30水平与ALT（r=0.639）和TG（r=0.390）水平均成正相关（均P0.05），而与血小板无相关性（P0.05）。 4.4NASH预测模型：Logistic回归分析得出NASH预测模型，具体公式为-12.764+0.075×ALT（U/L）+0.013×血小板（×109/L）+0.012×CK-18片段M30（U/L）+0.006×TG（mg/dL）。该模型的AUROC为0.920（95%CI：0.866-0.974），临界值为0.361，敏感性、阳性预测值和阴性预测值均为89%，特异性为86%。结论： 1应用D-氨基半乳糖腹腔注射小鼠可以成功复制ALF模型，其中血浆LPS水平的升高在ALF的发生发展中起着重要作用。 2ALF小鼠血浆中升高的LPS可使肝组织内巨噬细胞活化，激活细胞内Notch信号通路，促进晚期重要炎症介质HMGB1和抗炎细胞因子IL-10的分泌，其中以升高HMGB1为主，参与肝脏的炎症损伤过程，加速ALF的疾病进展。 3益生菌可通过降低ALF小鼠血浆LPS水平，减少肝组织中巨噬细胞的活化，抑制Notch信号转导，降低HMGB1和IL-10的水平，从而发挥保护肝脏的作用，为临床预防ALF提供了新的思路和方向。 4由CK-18、ALT、血小板和甘油三酯组成的无创诊断模型可准确预测NASH的发生，该模型可能在延缓NAFLD病情进展，改善患者预后及预防肝衰竭中发挥一定作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.3

【参考文献】