虫草素改善脑外伤大鼠模型中血脑屏障损害的机制研究

发布时间：2018-04-04 19:19

本文选题：虫草素　切入点：脑外伤　出处：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景及目的创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI),是指一类由各种外伤导致脑组织严重损害的疾病,具有高发生率、高致残率等特点,它的致死率、致残率居创伤的首位[1]。仅在美国,每年大约有170万例新病例报告,导致约5%的人死亡,超过40%的人长期残疾,和有25%的成年人受到影响,无法在TBI后1年返回正常工作[2-4]。而在发展中国家,随着社会经济水平不断提高,交通工具的普及、建筑的大力发展、高刺激运动的引入等等,使TBI的发病率呈持续升高的趋势。在TBI后可以出现相关的临床症状,造成广泛的心理和身体的障碍,包括运动障碍、癫痫、人格改变、记忆障碍、感觉障碍等。所以,TBI是一个影响公众的主要的健康问题。然而,目前仍没有经过FDA批准的脑外伤的治疗,对它的研究迫在眉睫。血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)完整性的破坏参与了多种疾病的发生、发展,包括缺血、多发性硬化和神经退行性疾病比如AD、帕金森病等[5-8]。通过影像学研究发现人的血脑屏障完整性在TBI后被破坏[9]Alluri等研究也发现脑外伤可引起BBB的完整性的损失,它可以不再是血管内皮和大脑之间完美的保护屏障,它的功能障碍导致液体、蛋白质和免疫细胞的渗出,从而形成血管源性脑水肿,继发一系列的神经损伤,甚至留下严重的神经功能障碍[10]。因此改善血脑屏障的破坏对于改善TBI的结局至关重要。生理状态下BBB对维持中枢神经系统内环境稳定具有重要意义。在血脑屏障的完整结构中,脑微血管内皮细胞由Occludin、Claudins和JAMS(junction Adhesion molecules)三种跨膜蛋白连接形成,其与紧密连接蛋白中闭锁小带蛋白-1(Zonulaoccludens-1,ZO-1)直接或间接结合,连接到细胞骨架蛋白,稳定整体的连接结构。而liu等研究发现ZO-1和occludin对血脑屏障很关键[11]。有研究发现在一个大鼠的寒冷损伤模型中,皮层产生纯血管源性水肿,在caveolin-1的表达增加的同时,发现了occludin和claudin-5表达的减少[12]。此外,BBB的完整性,也为某些生理条件的影响,包括炎症和氧化应激。局部炎症反应可导致血脑屏障破坏。在这一过程中,促炎性细胞因子,包括IL-1、iNOS、MPO和MMP-9,均可由脑损伤引起,同时抗炎症相关因子arginase-1和IL-10因为保护作用被激活。研究还发现中风后过量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)导致血脑屏障完整性的破坏,而NOXs是ROS的主要来源。[13-20]综上所述,脑外伤后导致血脑屏障的破坏,而维系血脑屏障的紧密连接蛋白异常及炎症和氧化应激均会导致血脑屏障通透性增加,从而出现血管源性水肿、颅内压增高,出现相应的临床症状,而治疗上目前无FDA批准的脑外伤的治疗,既往研究发现格列本脲、柴胡皂甙、丁酸钠等药物对创伤性脑损伤后的血脑屏障的破坏有保护作用,且Yang等对既往中草药治疗TBI的文献进行meta分析,结果显示中药对TBI治疗有益,且有明显的统计学意义,但有局限性,表明更精心设计和报告的动物研究是必要的[21-24]。虫草素(cordycepin)又称虫草菌素,具有抗炎、清除体内自由基抗氧化、抗肿瘤、抗白血病、抗菌、免疫调节、降血糖、降血脂等作用[25],Tuli等研究发现虫草素能明显减弱促炎症因子的水平,包括NO、PGE2、TNF-α和IL-1,同时增加抗炎因子的表达,如IL-10[26]。此外,虫草素可减少与年龄相关的氧化应激,改善大鼠抗氧化能力[27]。虫草素通过抗氧化性能和抑制凋亡细胞死亡来发挥对海马细胞的神经保护作用[28]。因此,有必要探讨虫草素是否对脑外伤后血脑屏障受损有保护作用。本实验通过使用TBI大鼠作为体外模型,运用多种技术,包括神经缺损严重程度的评价、伊万思蓝评估、实时荧光定量PCR、Western blotting和ELISA等,来探讨虫草素是否通过抑制炎症、抗氧化应激和紧密连接蛋白的减少来改善脑外伤后的血脑屏障破坏,并为临床上找到一种治疗TBI的新办法。方法1.使用SD大鼠随机分组并通过经典的控制皮层冲击伤装置制作TBI大鼠模型。2.损伤严重程度的评价。根据1996年chen[29]等进行神经损伤严重程度评分,采用10分量表,0分代表正常,10分代表最严重的神经功能缺损。3.脑含水量的测定:按照Hatashita等应用干湿重法测定伤后24小时脑组织含水量。[30]4.伊文思蓝的评价:通过术后伊万思蓝渗漏评价BBB的通透性。5.实时荧光定量PCR:损伤24小时后,组织匀浆后应用RNA裂解缓冲液,根据试剂盒指示分别提取RNA、合成cDNA和其后的qPCR来测定ZO-1、occludin、IL-Iβ、iNOS、MMP-9、arginase-1、NOX-1、NOX-2、NOX-4、GADPH 作为内参对照。6.Western blotting:如上所述,收集24小时后损伤组织,应用Western blotting来观察组成血脑屏障的ZO-1和Occludin的表达情况。7.ELISA:参照western blotting方法提取损伤24小时后总蛋白,根据试剂盒的指示来检测IL-10。最后结果是以pg/mg来显示.8.评估MPO和NOX的活性:应用MPO测试盒(比色法)和光泽精增强化学发光法来评估MPO和NOX的活性。9.统计:统计学处理所有数据采用GraphPadPrism软件统计分析(GraphPad软件、美国),用单因素方差分析和Tukey的事后检验法。P值小于0.05被视为统计学意义。每项实验至少重复三遍。结果1.虫草素治疗能改善TBI诱导的损伤,但呈剂量依赖假手术组大鼠接受相同的手术,但均没有影响皮质。TBI大鼠分别用生理盐水(对照组)或虫草素(1、5、10和20mg/kg)。不同实验组动物的脑卒中严重程度以神经系统损伤严重程度评分、脑含水量为特征。我们的研究结果表明,比假手术组,TBI大鼠有较高的神经功能缺损程度评分和更多的脑水含量。此外,给予虫草素干预治疗后,比对照组表现出较低的神经功能缺损程度评分和较少的脑水含量,表明虫草素可以治疗脑外伤引起的损伤。此外,虫草素的治疗作用具有剂量依赖性,在我们的实验中,20mg/kg的虫草素改善TBI的效果最好。2.虫草素治疗可保护TBI后的BBB的完整性。伊万思蓝可以评定BBB的完整性,因为伊万思蓝渗漏与BBB完整性的损失呈正相关。我们的研究发现对照组血脑屏障完整性受损,而20mg/kg虫草素治疗组可部分挽救TBI诱导的BBB完整性的损失。伊万思蓝的含量分析进一步证实,虫草素可治疗TBI诱导的血脑屏障完整性受损。此外,假手术组大鼠,作为阴性对照组,在受损的对侧,伊万思蓝含量和虫草素处理组没有差异。3.虫草素能减轻TBI诱导的同侧皮层紧密连接蛋白的损失。假手术组和TBI组相比较,假手术组大鼠的ZO-1和occludin转录水平较低。此外,在假手术组大鼠和假手术组+虫草素组之间及TBI+对照组和TBI+虫草素组之间ZO-1和occludin的mRNA水平各自相似。其后通过免疫印迹法检测两者的蛋白表达水平,结果显示与mRNA结果一致,TBI大鼠组(TBI +对照组和TBI+虫草素组)ZO-1和occludin蛋白水平较低。然而,对ZO-1和occludin蛋白条带强度的统计分析证实TBI+虫草素组显著高于TBI +对照组,表明虫草素能减轻TBI诱导紧密连接蛋白的损失,但不影响基因。总之,虫草素可能在转录后水平发挥神经保护作用。4.虫草素能抑制脑损伤同侧大脑的局部炎症。我们分析了促炎因子和抗炎因子的水平,包括IL-Iβ、iNOS、MMP-9、MPO和arginase-1、IL-10,正如预期的那样,局部炎症在TBI后同侧大脑引起,但被虫草素抑制。同时,TBI诱导的脑损害刺激抗炎症因子产生,而虫草素可以进一步加强这种作用。5.虫草素能抑制NADPH oxidase(NOX)在TBI后同侧大脑的表达和活性。我们的研究结果证实,脑损伤大鼠组NOX活性比对照组高,而虫草素治疗TBI大鼠组比TBI对照组大鼠NOX活性低。NOX-1、NOX-2和NOX-4是中枢神经系统中存在NOXs的三种类型[31]。我们进一步研究三种NOXs的mRNA的表达水平,发现在TBI诱导的大鼠中只有NOX-1,它却在TBI大鼠中虫草素治疗后被抑制。但NOX-2和NOX-4不受TBI诱导的损伤影响,也不被虫草素治疗影响。结论1.虫草素对脑外伤引起的脑损伤有保护作用,且呈剂量依赖性。2.虫草素可以改善脑外伤引起的血脑屏障的破坏。3.虫草素对血脑屏障的保护可能是通过恢复紧密连接蛋白ZO-1和occludin的转录后表达水平、抑制局部炎症反应和降低NOX-1的活性来实现。意义1.我们对虫草素改善创伤性脑损伤后血脑屏障完整性损害的机制进行了探讨,首次提出虫草素对脑外伤后血脑屏障的保护作用,发现虫草素可以通过减少血脑屏障相关的紧密连接蛋白转录后表达的丢失和通过抑制NOX-1而不是NOX-2、NOX-4的活性来改善脑外伤后血脑屏障的损害。2.虫草素治疗创伤性脑损伤大鼠有效,为我们治疗创伤性脑损伤提供了一个新的治疗方法,具有广阔的前景。
[Abstract]:Background and Objective Traumatic brain injury is a kind of diseases caused by various trauma , such as high incidence rate , high disability rate and so on . In the United States alone , about 1.7 million new cases report annually , causing about 5 % of people to die , more than 40 % of those with long - term disability , and 25 % of adults . Therefore , it is very important to improve the outcome of blood brain barrier . BBB is very important in maintaining the stability of the central nervous system . In the intact structure of the blood brain barrier , the endothelial cells of brain microvascular endothelial cells are formed by three transmembrane protein connections , which are directly or indirectly bound to the small band protein - 1 ( zonulatio dens - 1 , ZO - 1 ) in the tight connexin . It was found that in a cold injury model of a rat , the cortical layer produced pure angioedema , while the expression of cyclin din and claudin - 5 was reduced at the same time as the expression increased . In addition , the integrity of BBB is also influenced by some physiological conditions , including inflammation and oxidative stress . Local inflammatory reaction can lead to the destruction of blood brain barrier . In this process , pro - inflammatory cytokines , including IL - 1 , iNOS , MPO and MMP - 9 , can be caused by brain injury , while anti - inflammatory factors such as IL - 1 , iNOS , MPO and MMP - 9 can be activated by protective action . Conclusion Traditional Chinese medicine has the protective effect on the blood - brain barrier after traumatic brain injury . The results show that the traditional Chinese medicine has the protective effect on the blood - brain barrier after traumatic brain injury , and the result shows that the traditional Chinese medicine has the advantages of anti - inflammatory , free radical oxidation , anti - tumor , anti - leukemia , anti - bacterial , immunoregulation , blood sugar reduction and blood fat reducing . In addition , cepin can reduce age - related oxidative stress and improve the antioxidant capacity of rats . Cordyceps sinensis plays a role in neuroprotection of hippocampus cells by inhibiting oxidation resistance and inhibiting apoptosis cell death . In this experiment , it is necessary to study whether or not it has protective effect on blood - brain barrier after brain injury . This experiment uses multiple techniques , including evaluation of severity of nerve defect , Evans blue evaluation , real - time fluorescence quantitative PCR , Western blotting and ELISA . The expression of MPO and NOx was assessed by Western blotting and Western blotting . 5 . Cordyceps sinensis could inhibit the expression and activity of NADPH oxidase ( NOx ) in the ipsilateral brain following the development of the rats . The results of our study confirmed that the activity of NOx in the rats with brain injury was higher than that in the control group , while those in the control group were lower than those in the control group . The NOX - 1 , NOx - 2 and NOx - 4 were the three types of NOx31 in the central nervous system . 1 . The protective effect of cepin on the blood - brain barrier induced by brain injury was discussed . The protective effect of cepin on blood - brain barrier induced by brain injury was discussed .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R651.15;R-332

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