慢病毒介导的miR-210对猪急性心肌梗死血管新生影响及机制的研究

发布时间：2018-04-07 15:12

本文选题：急性心肌梗死模型　切入点：小型猪　出处：《郑州大学》2014年博士论文

【摘要】：急性心肌梗死是在冠状动脉病变的基础上,发生冠脉内粥样斑块破裂引起冠脉急性闭塞并导致前向血流中断,使相应的心肌严重而持久地急性缺血、缺氧导致心肌坏死的临床综合征。AMI的治疗方法包括药物治疗(冠脉溶栓等)、介入(支架)治疗、冠状动脉旁路移植术等。发展较快的治疗方式对改善AMI的预后起到了积极的作用,但AMI仍严重威胁着人类的生命安全,临床上必须高度重视,紧急处理并寻求最佳治疗方法。梗死区内是否有血管迅速生成或残留的血管是否重新开放与心肌梗死的修复过程密切相关,心梗后快速建立良好的侧支循环来改善梗死区血液供应,促进梗死区心肌细胞存活具有非常重要的意义。血管生成是指在原有血管结构上长出新血管的生物学过程。血管生成是一个多步骤受到严密调控的复杂过程,这些调控主要通过以VEGF为代表的多种因子在时间和空间上协同作用,共同促进血管生成的进行。近年来,随着对AMI梗死区血管新生和血管生长因子研究的不断深入,通过调控梗死区多种血管生成相关因子的表达来刺激缺血区微血管生成,促进侧支循环的建立便成了AMI治疗的十分诱人且直观合理的方法。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是近年发现的一种长度为18~26核苷酸的单链内源性非编码小RNA,其序列高度保守,通过与靶基因序列特异性相互作用,介导靶基因转录模板的降解或抑制其翻译,在转录及转录后水平调节相关基因的表达,从而影响包括发育、分化、增殖和凋亡等多种生物学过程。mi RNA表达的上调或下调足以引起一些特异性的心血管疾病的发生和发展,通过纠正那些异常表达的mi RNA可以为某些心血管疾病的治疗提供新方向。mi R-210是血管内皮上的特殊的mi RNA,其靶基因Ephrin-A3是VEGF介导血管新生信号通路的重要信号分子,mi R-210在心梗后的血管发生和维持血管的完整性上起着重要作用。我们推测mi R-210通过靶基因Ephrin A3影响VEGF信号通路并调控梗死区多种血管生成相关因子的表达,刺激梗死及边缘区血管生成,促进侧支循环的形成。为此,我们拟将稳定过表达mi R-210的慢病毒载体首先体外应用于血管内皮细胞,研究其对内皮细胞增殖、迁移及血管形成能力的影响;然后注射入小型猪急性心梗模型梗死及边缘区,研究其对心梗小型猪心功能及血管生成的影响,并对其作用机制进行评估和探讨,以期望为AMI治疗探索一条新途径。第一部分mi R-210慢病毒载体的构建、鉴定及包装目的通过基因工程技术将mi R-210前体序列克隆至p LVTHM慢病毒表达载体,构建p LVTHM/mi R-210慢病毒表达载体,为后续研究mi R-210对猪急性心肌梗死血管新生的影响及机制提供了良好的载体。方法由mi RBase数据库获得pre-ssc-mi R-210序列,利用聚合酶链反应从猪基因组中扩增mi R-210的前体;将mi R-210前体序列和p LVTHM载体经Mlu I和Cla I双酶切后连接,构建p LVTHM/mi R-210重组慢病毒表达载体。双酶切和测序鉴定,筛选阳性克隆;以p LVTHM/mi R-210、ps PAX2和p MD2.G质粒共转染并包装HEK-293T细胞,包装产生慢病毒并测定滴度。结果经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了包含mi R-210的慢病毒表达载体p LVTHM/mi R-210;倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞HEK-293T表达绿色荧光。慢病毒滴度测定结果显示病毒滴度符合继续实验要求。结论成功构建了包含mi R-210的慢病毒表达载体p LVTHM/mi R-210,成功进行病毒包装,病毒滴度符合实验要求,为进一步深入研究mi R-210对猪急性心肌梗死血管新生的影响及机制提供了良好的载体。第二部分p LVTHM/mi R-210体外转染促血管内皮细胞增殖、迁移及分化作用的研究目的研究p LVTHM/mi R-210载体能否有效感染内皮细胞,以及过表达mi R-210对内皮细胞增殖、迁移及血管形成能力的影响。方法p LVTHM/mi R-210慢病毒感染血管内皮细胞,CCK-8实验测定各组细胞增殖情况;Transwell小室检测各组细胞迁移能力;血管形成实验检测各组细胞血管形成能力;q PCR检测各组细胞mi R-210表达相对含量;酶联免疫吸附法检测不同组别细胞上清液中VEGF含量。结果p LVTHM/mi R-210慢病毒感染血管内皮细胞效率在70%以上,各组细胞形态无明显差别;CCK-8检测结果显示mi R-210组细胞生长曲线上升较为迅速,增殖速度显著高于空载体组及对照组,72h为mi R-210组内皮细胞增殖高峰期;Transwell小室检测结果显示mi R-210组侵袭细胞数目显著高于空载体组及对照组;不同组别血管内皮细胞在Matrigel胶中检测血管形成能力,结果显示mi R-210组管状分枝点数显著高于空载体组及对照组;q PCR检测结果显示mi R-210组血管内皮细胞中mi R-210相对表达量远高于对照组及空载体组;mi R-210组细胞上清液中VEGF含量显著高于空载体组及对照组。结论p LVTHM/mi R-210能有效感染内皮细胞。mi R-210促进血管内皮细胞增殖、迁移及血管形成能力可能与mi R-210促进ECs分泌VEGF密切相关。第三部分小型猪急性心肌梗死模型的建立及评价目的结扎小型猪冠状动脉左前降支(Left Anterior Desending Branch,LAD)建立急性心肌梗死模型,并评价其效果。方法选取实验用小猪8只,常规全身麻醉,气管插管,平卧于导管室手术台,四肢妥善固定,并同时给予实时心电监护、血压监测,置入经食管超声探头,连接心脏超声仪。全身肝素化,经股动脉穿刺并留置鞘管,先行冠状动脉造影(Coronary Artery Angiography,CAG)证实其左前降支及其他冠状动脉通畅,无狭窄或闭塞等病变。左前胸局部备皮,开胸,打开心包,显露冠状动脉左前降支,在第一对角支远端约1.5~2cm处以缝线结扎左前降支,构建急性心肌梗死模型。心电监护及描图提示多个导联ST段明显弓背向上抬高,结扎部位以远左室前壁及心尖部颜色变暗、变紫、变白,心尖部室壁运动明显减弱或消失,冠状动脉造影显示左前降支完全梗阻,证明造模成功。止血,关胸。待猪自主呼吸恢复后拔除气管插管。检测术前及术后24h心肌损伤标志物CK、CK-MB、c Tn I等。术后2d开始进食,术后3d内给予抗生素。术后第2周,复查经食管超声心动图、冠状动脉造影及心肌核素灌注显像(Emssion Computed Tomography,ECT)检查;术后第6周(实验结束后),全麻后静脉注射氯化钾,处死动物,剖出心脏,取出左前降支供应区域的缺血区及正常区左心室心肌,行相关病理学检查。结果8头小型猪中有6头存活,成活率75%。冠状动脉左前降支完全结扎、血流阻断后,可见心电图ST段下斜形或弓背状抬高,持续0.5h,为急性心肌梗死心电图表现。前降支结扎24h后血清心肌酶谱(CK、CK-MB、c Tn I)较术前显著增高2倍以上,差异有统计学意义(p0.05);经食管超声心动图检查结示造模后与造模前比较实验动物心功能明显降低:EF、FS显著降低,LVESD、LVEDD、LVEDV等显著增大,有统计学意义(p0.05);冠状动脉造影显示造模后左前降支血流完全中断,TIMI血流分级为0级;ECT示前降支远段支配区域较术前明显灌注缺损;术后病理检查结果显示梗死区心肌细胞结构紊乱、排列不齐,肌细胞数量减少,细胞核大小不甚规则,细胞分界不清楚。结论利用冠状动脉结扎法制备小型猪急性心肌梗死模型,心电监护显示ST段弓背向上抬高持续0.5h;心肌酶学CK、CK-MB和c Tn I均增高2倍以上;超声心动图显示心功能显著减低;冠状动脉造影显示左前降支中远段结扎部位处完全闭塞;心肌ECT示前降支中远段供应区域明显灌注缺损。成功建立了小型猪急性心肌梗死模型。第四部分p LVTHM/mi R-210对急性心肌梗死血管新生的影响及机制的研究目的将p LVTHM/mi R-210注射到小型猪心肌梗死及边缘区,4周后通过经食道超声心动图、冠状动脉造影、心肌核素灌注显像、梗死区域新生血管密度及Ephrin-A3与VEGF等相关指标及参数的观察,探讨mi R-210对小型猪急性心肌梗死区血管新生的影响与机制。方法小型猪开胸结扎冠状动脉前降支2周后,将AMI模型动物随机分为3组:I.模型组,在左心室前壁梗死及梗死边缘区心肌分10点将PBS注射到梗死区域,每点间隔1cm;II.空载体组,将p LVTHM空载体点状注射到梗死区域;III.mi R-210组,将p LVTHM/mi R-210点状注射到梗死区域(1X1011virus particles/点),治疗后4w复查经食管超声心动图、冠脉造影及心肌核素灌注显影,开胸取出心脏进行心脏病理改变检测,留取标本荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达;酶联免疫技术检测血清中ET及VEGF的含量的变化;免疫组化检测CD31因子特异性内皮标记,同时利用RT-PCR及免疫印迹测定各组中Ephrin-A3、VEGF m RNA及蛋白含量。结果移植4周后,经食管超声心动图结果显示mi R-210组心功能均较移植前有明显改善,各项指标均与模型组存在统计学差异(p0.05),模型组与空载体组无显著性差异(p0.05);冠脉造影结果显示mi R-210组梗死区有相对明显的细小侧枝形成,mi R-210组TIMI评级高于模型组,存在统计学差异(p0.05),模型组与空载体组无显著性差异(p0.05);心肌ECT提示mi R-210组缺损面积百分比均低于模型组及空载体组,差异有统计学意义(p0.05),模型组与空载体组无显著性差异(p0.05);荧光显微镜检查结果显示,mi R-210组小型猪心肌梗死区组织切片可见绿色荧光,模型组无任何荧光;酶免实验结果显示mi R-210组血清中ET-1显著低于模型组及空载体组,差异有统计学意义(p0.05),模型组与空载体组无显著性差异(p0.05);VEGF含量则显著增加;CD31染色可见mi R-210组缺血心肌组织的血管新生均明显增强,显著高于模型组,差异有统计学意义(p0.05),模型组与空载体组无显著性差异(p0.05);RT-PCR及免疫印迹结果显示mi R-210组梗死区组织中Ephrin-A3 m RNA及蛋白显著低于模型组,有统计学意义(p0.05),模型组与空载体组无显著性差异(p0.05);mi R-210组梗死区组织中VEGF m RNA及蛋白显著高于模型组,有统计学意义(p0.05),模型组与空载体组无显著性差异(p0.05)。结论将p LVTHM/mi R-210注射入小型猪心肌梗死区,4w后可明显增加该区新生血管数量,促进梗死区血管新生,利于冠状动脉侧支循环的建立,增加心肌血流量,改善心功能。mi R-210促进新生血管形成可能与mi R-210过表达引起的Ephrin-A3表达的降低及VEGF表达增加密切相关。
[Abstract]:Acute myocardial infarction ( AMI ) is a very attractive and intuitive method for the treatment of acute myocardial infarction . The recombinant lentivirus expression vector pLVTHM / mi R - 210 containing mi R - 210 was successfully constructed . The results showed that the expression of mi R - 210 was significantly higher in mi R - 210 group than in control group and control group . The myocardial enzyme spectrum ( CK , CK - MB , c Tn I ) of the left anterior descending branch was significantly decreased after operation . The myocardial enzyme spectrum ( CK , CK - MB , c Tn I ) increased more than 2 times in the left anterior descending branch . The effect and mechanism of mi R - 210 on angiogenesis in acute myocardial infarction were studied by echocardiography , coronary angiography , myocardial nuclear perfusion imaging , myocardial infarction area neovascularization and Ephrin - A3 . There was no significant difference between the model group and the empty vector group ( p < 0.05 ) . The expression of Ephrin - A3 in the infarct zone was significantly higher than that in the model group ( p < 0.05 ) .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R542.22

【参考文献】