慢病毒介导的miR-126稳定过表达骨髓间充质干细胞对猪急性心肌梗死血管生成影响及机制的研究

发布时间：2018-04-07 18:34

  本文选题：急性心肌梗死模型　切入点：小型猪　出处：《郑州大学》2014年博士论文

【摘要】：急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction, AMI)是在冠状动脉病变的基础上,由冠状动脉内粥样硬化斑块的突然破裂,继而出血和管腔内血栓形成,致冠状动脉血供急剧减少或突然中断,使相应区域的心肌严重而持久地急性缺血、缺氧进而导致心肌坏死的临床综合征。 目前,急性心肌梗死的治疗方法包括药物治疗(冠脉溶栓等)、介入治疗(球囊扩张或支架)以及冠状动脉旁路移植术等。虽然近年来不断涌现的新型治疗方式和工业化设备对改善急性心肌梗死的预后起到了积极的作用,但急性心肌梗死仍严重威胁着人类的生命,临床上必须高度重视,紧急处理并进一步寻求最佳治疗方法。 众所周知,心肌梗死的修复过程与血管的结构及功能状态密切相关,梗死区内是否有血管迅速生成或残留的血管是否重新开放,对于心肌梗死后建立良好的侧支循环来改善梗死区血液供应及梗死区心肌的存活具有非常重要的意义。血管生成是一个多步骤、且受到严密调控的复杂过程,这些调控主要是通过多种因子在时间和空间上协同作用,共同促进血管生成。近年来,随着对AMI梗死区血管新生和血管生长因子研究的不断深入,通过调控梗死区多种血管生成相关因子的表达来刺激缺血区小血管生长,促进侧支循环的建立便成了AMI治疗的十分诱人且直观合理的方法。 骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSC)是一种多能成体干细胞,具有多向分化的潜能,可分化为血管内皮细胞、心肌细胞、软骨细胞等。BMSC具有很强大的旁分泌能力,它们在心肌微环境中能通过自分泌或旁分泌VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)等多种促血管新生的细胞因子,刺激局部血管和心肌细胞的增生,抑制缺血区心肌细胞凋亡。 微小RNA(microRNA, miRNA)是近年发现的一种长度为18-26核苷酸的单链内源性非编码小RNA,其序列高度保守,通过与靶基因序列特异性相互作用在转录水平调节基因表达,与其目标mRNA分子的3’端非编码区(3'-Untranslated Regions,3'-UTR)互补匹配发挥负性调节作用,参与多种生物学过程。近年来有学者认为miRNA可以作为干细胞移植治疗AMI的一个新的切入点。而miRNA-126(miR-126)是目前报道的与血管内皮细胞及血管功能密切相关的miRNA,主要在心、肺组织中高度表达,其缺失可延迟血管芽生,致血管完整性破坏。 我们推测miR-126通过对BMSC的调节来调控梗死区多种血管生成相关因子的表达,刺激缺血区血管生长,促进侧支循环的形成。为此,我们拟将稳定过表达miR-126的BMSC应用于小型猪急性心梗模型,并对其应用效果及作用机制进行评估和探讨,以期望为AMI治疗探索一条新途径。 第一部分慢病毒介导的miR-126稳定过表达骨髓间充质干细胞的建立目的 建立BMSC的分离、培养方法,研究其在体外生长增殖的生物学特性及表型特征；构建pCDH-miR-126慢病毒表达载体,建立稳定过表达miR-126的miR-126-BMSC。方法 应用Percoll细胞分离液,采用密度梯度离心法分离猪骨髓间质干细胞,并进行培养和传代。应用MTT方法测定培养细胞的生长曲线,应用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞。构建慢病毒表达质粒pCDH-miR-126,用HEK293T细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染BMSC细胞,建立稳定过表达miR-126的BMSC。最后用qPCR检测miR-126的表达水平。 结果 原代培养的BMSC24h内贴壁并伸展成多角形、梭形,前3天为相对抑制期,其后细胞增殖速度逐渐加快,呈对数形式,7天左右至平台期,细胞覆盖率达95%左右,传至第3代时可到106个数量级细胞,能够满足细胞移植数量的需要,应用流式细胞仪检测BMSC的标志,显示CD44阳性,而CD34阴性,符合BMSC特征。 PCR和酶切电泳验证pCDH-miR-126重组质粒构建成功；经HEK293T细胞病毒包装,感染BMSC细胞后,miR-126-BMSC表达miR-126水平明显升高。 结论 利用Percoll细胞分离液,采用梯度密度离心法成功分离出较为均一的骨髓间质干细胞；体外培养生长稳定,传代后细胞生长较快。 成功构建pCDH-miR-126慢病毒重组质粒,建立了稳定表达miR-126的骨髓间充质细胞株miR-126-BMSC,为研究miR-126对猪心肌梗死血管生成的影响及机制提供了有用的细胞模型。第二部分小型猪急性心肌梗死模型的建立及评价目的 结扎小型猪冠状动脉左前降支(Left Anterior Desending Branch,LAD)建立急性心肌梗死模型,并评价其效果。方法 选取实验用小猪12只,常规全身麻醉,气管插管,平卧于导管室手术台,四肢妥善固定,并同时给予实时心电监护、血压监测,置入经食管超声探头,连接心脏超声仪。全身肝素化,经股动脉穿刺并留置鞘管,先行冠状动脉造影(Coronary Artery Angiography,CAG)证实其左前降支及其他冠状动脉通畅,无狭窄或闭塞等病变。左前胸局部备皮,开胸,打开心包,显露冠状动脉左前降支,在第一对角支远端约1.5-2cm处以缝线结扎左前降支,构建急性心肌梗死模型。心电监护及描图提示多个导联ST段明显弓背向上抬高,结扎部位以远左室前壁及心尖部颜色变暗、变紫、变白,心尖部室壁运动明显减弱或消失,冠状动脉造影显示左前降支完全梗阻,证明造模成功。止血,关胸。待猪自主呼吸恢复后拔除气管插管。检测术前及术后24h心肌损伤标志物CK、CK-MB、 cTnI等。术后2d开始进食,术后3d内给予抗生素。术后第2周,复查经食管超声心动图、冠状动脉造影及心肌核素灌注显像(Emssion Computed Tomography, ECT)检查；术后第6周(实验结束后),全麻后静脉注射氯化钾,处死动物,剖出心脏,取出左前降支供应区域的缺血区及正常区左心室心肌,行相关病理学检查。 结果 12头小型猪中有9头存活,成活率75%。冠状动脉左前降支完全结扎、血流阻断后,可见心电图ST段下斜形或弓背状抬高,持续0.5h,为急性心肌梗死心电图表现。前降支结扎2411后血清心肌酶谱(CK, CK-MB、cTnI)较术前显著增高2倍以上,差异有统计学意义(p0.05)；经食管超声心动图检查结示造模后与造模前比较实验动物心功能明显降低：EF、FS显著降低,LVESD、LVEDD. LVEDV等显著增大,有统计学意义(p0.05)；冠状动脉造影显示造模后左前降支血流完全中断,TIMI血流分级为0级；ECT示前降支远段支配区域较术前明显灌注缺损；证实心梗模型建立成功。术后病理检查结果显示梗死区心肌细胞结构紊乱、排列不齐,肌细胞数量减少,细胞核大小不甚规则,细胞分界不清楚。 结论 利用冠状动脉结扎法制备小型猪急性心肌梗死模型,心电监护显示ST段弓背向上抬高持续0.5h;心肌酶学CK、CK-MB和cTnI均增高2倍以上；超声心动图显示心功能显著减低；冠状动脉造影显示左前降支中远段结扎部位处完全闭塞；心肌ECT示前降支中远段供应区域明显灌注缺损。成功建立了小型猪急性心肌梗死模型。 第三部分miR-126-BMSC对小型猪急性心肌梗死区血管生成的影响 目的 将miR-126-BMSC注射到小型猪心肌梗死区域,4周后通过对超声心动图、冠状动脉造影、心肌核素灌注显像、梗死区域新生血管密度及血管内皮生长因子等相关指标及参数的观察,探讨miR-126-BMSC对小型猪急性心肌梗死区血管新生的影响与机制。 方法 制模2周后,将实验动物随机分为3组：组I.模型组(n=3)：即对照组,对梗死区心肌组织内注射PBS；组Ⅱ.BMSC组(n=3)：对梗死区心肌组织内注射BMSC;组Ⅲ. miR-126组(n=3)：对梗死区心肌组织内注射miR-126-BMSC.移植(注射)后4周复查经食管超声心动图、冠脉造影及心肌核素灌注显影,开胸取出心脏进行心脏病理改变检测,留取标本荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达；免疫组化检测VIII因子特异性内皮标记,同时利用RT-PCR及免疫印迹测定各组中VEGF mRNA及蛋白含量。 结果 移植4周后,经食管超声心动图示BMSC组及miR-126组心功能均较移植前有明显改善,且均与模型组存在统计学差异(p＜0.05),其中miR-126组EF、 FS改善程度及LVEDD、LVESD减小程度要明显高于单纯BMSC移植组p0.05)；冠脉造影示miR-126组梗死区有相对明显的细小侧枝形成,BMSC组及miR-126组TIMI评级高于模型组,且miR-126组高于BMSC组,存在统计学差异(p＜0.05)；心肌ECT提示BMSC组及miR-126组缺损面积百分比均低于模型组,且miR-126组明显低于BMSC组,差异有统计学意义(p＜0.05)；荧光显微镜检查显示,BMSC组和miR-126组小型猪心肌梗死区组织切片可见绿色荧光,模型组无任何荧光,细胞计数示miR-126组明显高于BMSC组(p＜0.05)；Ⅷ因子染色可见BMSC组和miR-126组缺血肌肉组织的血管新生均明显增强,以miR-126组的血管密度最高,差异有统计学意义(p＜0.05)。RT-PCR及免疫印迹结果显示BMSC组和miR-126组梗死区组织中VEGF mRNA及蛋白显著高于对照组,以miR-126组表达最高(p＜0.05)。 结论 将miR-126-BMSC注射入小型猪心肌梗死区,可明显增加该区域新生血管数量,促进梗死区血管新生,利于冠状动脉侧支循环的建立,增加心肌血流量,改善心脏功能。miR-126-BMSC促进新生血管形成可能与miR-126过表达引起的VEGF mRNA及其蛋白的表达增加密切相关。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R542.22

【参考文献】

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本文编号：1720372