过氧化物酶体增殖物激活受体α与内质网应激在急性肝衰竭中的作用及机制

发布时间：2018-04-25 18:20

本文选题：过氧化物酶体增殖物激活受体α + 内质网应激　；参考：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：背景:肝衰竭是由多种因素引起的严重肝脏损害,导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿,出现以凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群。急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是短时间内发生的以大量肝细胞凋亡和坏死为特征的严重危及生命的临床综合征,病死率高达50%-70%。ALF常由肝炎病毒感染、药物、酒精、毒物等因素诱发,其发病机制复杂,目前认为主要是免疫损伤、缺血缺氧性损伤和内毒素血症等促进炎症反应及细胞凋亡,最终导致ALF。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是细胞蛋白合成、折叠、运输及钙离子储存的场所,肝细胞中有大量的内质网发挥调控蛋白质、脂质代谢和细胞信号转导等生物学功能。病毒感染、酒精或化学物质等均可使肝细胞发生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),严重的ERS可以诱导细胞凋亡。已有研究表明,ERS在D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)/脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)联合注射诱导小鼠ALF中发挥重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activatedreceptoralpha,PPARα)是由配体激活的核转录因子,参与了脂质代谢、炎症、细胞分化与凋亡等反应。在肿瘤细胞中,一方面PPARα的抗凋亡作用,促进肿瘤形成;另一方面PPARα通过调控微环境抑制肿瘤生长,提示PPARα在肿瘤细胞生长过程中的"双刃剑"作用。但有关PPARα在ALF发病中作用的文献还较为有限。PPARα具有抗凋亡作用,严重的ERS导致细胞凋亡,PPARα与ERS间是否具有关联、并可互相调控呢?目前关于两者关系的研究也存在争议,已有研究表明:激活PPARα可增加细胞ERS,另有学者应用基因敲除技术发现PPARα缺失也可增加肝细胞的ERS,因此PPARα对细胞ERS的作用较为复杂。我们前期的研究已经证实活化PPARα通过促进细胞自噬,可以减轻肝组织的炎症反应,对D-GaIN/LPS诱导的急性肝衰竭小鼠产生保护作用。但在以大量肝细胞凋亡和坏死为特点的ALF中,PPARα抗凋亡作用效应如何目前尚无研究。目的:本研究在腹腔注射D-GalN/LPS建立的C57BL/6小鼠ALF模型上应用 PPARα 激动剂 Wy-14643、PPARα 小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)及 ERS 抑制剂 4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)分别调控PPARα和ERS水平,通过检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT),天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平,观察肝组织的病理改变,肝组织内PPARα、ERS和凋亡相关分子mRNA和蛋白表达变化,探讨PPARα、ERS及其相互调控在ALF发生发展中的作用;进一步分离小鼠原代肝细胞,应用ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)、毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)建立细胞 ERS 模型,应用Wy-14643或PPARα siRNA调控PPARα的表达,观察细胞存活率,细胞上清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,细胞内PPARα、ERS和细胞凋亡相关指标的表达变化,明确PPARα在ERS进展中的变化及对细胞凋亡的影响,从而深入探讨PPARα与ERS在ALF中的作用和机制。从整体、组织、细胞水平探讨PPARα对于ALF的可能作用机制,为临床应用PPARα治疗ALF提供新的理论基础和实验依据。方法:1 PPARα对急性肝衰竭小鼠内质网应激和凋亡的影响健康清洁级8-12周雄性C57BL/6小鼠,重20-25g,用标准饲料喂养1周后,将小鼠随机分为3组:①对照组(n=10);②ALF模型组(n=22);③PPARα激动剂(Wy-14643)组(n=22),通过腹腔注射溶于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)中的D-GalN(700mg/kg)/LPS(10μg/kg)建立ALF模型,PPARα激动剂组于造模前2小时通过尾静脉注射溶于二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中的Wy-14643(6mg/kg),对照组及模型组于造模前2小时注射等量DMSO。ALF模型组和PPARα激动剂组各取10只,观察其精神状态、活动及24小时生存率。每组剩余小鼠造模6小时后处死,获取血清、肝组织。应用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST水平;取部分肝组织以10%中性福尔马林溶液固定,用于常规苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色;TUNEL法检测肝细胞凋亡和坏死情况;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测肝组织葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,Grp78)、葡萄糖调节蛋白 94(glucose-regulated protein 94,Grp94)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)mRNA表达;Western Blot检测Grp78、Grp94、CHOP、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinnyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)、Cleaved caspase-3蛋白表达。2内质网应激在急性肝衰竭中对PPARa的调控作用健康清洁级C57BL/6小鼠,分为两部分。第一部分:将小鼠随机分为3组:①对照组(n=10);②ALF模型组(n=14);③ERS抑制剂(4-PBA)组(n=14),ERS抑制剂4-PBA(100mg/kg)于造模前6小时通过尾静脉注入小鼠体内,造模6小时后将其处死,应用qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光法检测PPARα在肝组织中的表达及分布。第二部分:将小鼠随机分为5组:①对照组(n=10);②ALF模型组(n=24);③ERS抑制剂(4-PBA)组(n=24);④4-PBA+ControlsiRNA组(n=14);⑤4-PBA+PPARαsiRNA组(n=24),ControlsiRNA(50μM/kg)和PPARαsiRNA(50μM/kg)于造模前24小时通过尾静脉注入小鼠体内。ALF模型组、ERS抑制剂(4-PBA)组、4-PBA+PPARαsiRNA组,每组各取10只,观察24小时生存率,其余小鼠均于造模6小时后处死,获取血清、肝组织。应用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST水平;取部分肝组织用于HE染色;qRT-PCR和Western Blot法检测小鼠肝组织Grp78、Grp94、CHOP mRNA和蛋白表达。3 PPARa调节内质网应激诱导细胞凋亡的作用机制分离小鼠原代肝细胞,用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基培养。应用衣霉素(tunicamycin,TM)、毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)诱导细胞 ERS,Wy-14643 激活 PPARα。实验分组:首先向肝细胞内加入含TM或TG的DMSO溶液,TM(40μg/ml)或TG(1μg/ml)分别孵育肝细胞3小时、6小时、12小时、24小时;或加入TM 浓度分别为 2.5,5,10,25,or 50μg/ml 或 TG 浓度分别为 0.25,0.5,1,2.5,or 5μg/ml的DMSO溶液,分别孵育肝细胞12小时,单加DMSO为对照组。qRT-PCR肝细胞中PPARα mRNA表达,Western Blot分别检测PPARα、CHOP、Cleaved caspase-3蛋白表达。随后将肝细胞分为以下6组:①对照组;②PPARα siRNA组;③TM组;④TM+PPARα siRNA组;⑤TG 组;⑥TG+PPARαsiRNA 组,PPARα siRNA(5nM)提前 24 小时转染入细胞内,之后TM(40μg/ml)或TG(1μg/ml)分别作用6小时。最后将肝细胞分为以下6组:①对照组;②Wy-14643组;③TM组;④TM+Wy-14643 组;⑤TG组;⑥TG+Wy-14643 组,Wy-14643(50μM)提前2小时加入细胞内,之后TM(40μg/ml)或TG(1μg/ml)分别作用24小时。MTT法检测细胞存活率;LDH活力定量测定试剂盒检测细胞上清液 LDH 活性;Western Blot 检测肝细胞中 PPARα、CHOP、Cleaved caspase-3蛋白表达。结果:1 PPARα对急性肝衰竭小鼠内质网应激和细胞凋亡的影响1.1急性肝衰竭小鼠PPARα表达受抑,细胞凋亡增加我们前期的结果已经证实PPARα在ALF时表达降低,肝组织PPARαmRNA和蛋白表达水平在ALF进展过程中逐渐降低。ALF模型组小鼠,注射D-GalN/LPS 6小时后开始死亡,24小时的生存率是60%;血清ALT(1465.15±559.81U/L)、AST(4037.83±1774.55U/L)水平明显增高;光镜下,正常肝小叶结构破坏,肝索解离,肝细胞崩解、弥漫性大片坏死,大量炎性细胞浸润;肝组织内可见大量TUNEL阳性细胞;且Caspase-3蛋白表达量较对照组明显减少,Cleaved caspase-3表达量明显增加(P均0.01)。1.2激活PPARα减少肝细胞的凋亡,对急性肝衰竭产生保护作用。与ALF模型组相比,PPARα的选择性激动剂组小鼠24小时的生存率是 90%;血清 ALT(524.53±380.83U/L)、AST(1227.15±362.84U/L)水平降低;肝小叶结构较完整,肝细胞坏死及炎性细胞浸润程度均得到改善;TUNEL阳性细胞减少;且与TUNEL结果一致,Caspase-3的表达明显增多,Cleaved caspase-3的表达明显减少,且差异均具有统计学意义(P均0.01)。1.3激活PPARα减轻D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭小鼠内质网应激ALF模型组小鼠肝组织内ERS的标志物Grp78、Grp94、CHOPmRNA和蛋白较正常对照组明显增加;而Wy-14643预处理组上述指标的表达水平较ALF模型组明显减少,差异有统计学意义(P均0.05)。2内质网应激在急性肝衰竭中对PPARα的调控作用2.1抑制内质网应激促进D-GalN/LPS诱导的急性肝衰竭小鼠PPARα的表达我们前期结果已经证实PPARα在ALF时表达随着ALF进展过程中逐渐降低。体内、体外实验已经证实4-PBA可以减少ERS的发生。qRT-PCR和Westwern Blotting结果显示,与ALF组相比,4-PBA预处理组明显促进PPARα的表达。肝组织免疫荧光检测可以看到相同的结果,而且PPARα表达在胞浆而不是胞核(P均0.05)2.2抑制内质网应激通过激活PPARα保护急性肝衰竭小鼠4-PBA可以提高ALF小鼠的生存率;降低血清ALT、AST水平;保持肝小叶结构的基本完整,减少肝细胞坏死和炎细胞浸润;降低ERS标志物Grp78、Grp94、CHOPmRNA和蛋白的表达。然而当我们用siRNA抑制PPARα的表达,明显逆转了 4-PBA的保护作用:小鼠生存率降低;血清ALT,AST水平升高;肝小叶结构破坏加重以及ERS标志物Grp78、Grp94、CHOP表达明显增高(P均0.05)。3 PPARα调节内质网应激诱导细胞凋亡的作用机制3.1 PPARα在细胞内质网应激发展过程中的动态变化及与细胞凋亡的关系qRT-PCR和Westwern Blotting结果显示与对照组相比,短时间或低剂量TM、TG干预,PPARα表达增加,CHOP和Cleaved caspase-3表达减少;相反,长时间或高剂量的TM或TG干预,PPARα表达降低,CHOP和Cleaved caspase-3的表达增加(P均0.05)。因此,轻度的ERS促进PPARα表达,减少肝细胞凋亡,严重的ERS减少PPARα表达,增加细胞凋亡。3.2调节PPARα影响内质网应激诱导的细胞凋亡3.2.1下调PPARα减少轻度内质网应激促进的细胞存活轻度ERS条件下,即TM或TG孵育细胞6小时,PPARα表达增加,细胞存活率由于TM、TG的作用轻度下降,细胞上清中的LDH活性升高。我们用siRNA敲除PPARα,细胞存活率明显下降,细胞上清中的LDH活性明显增高。Western Blot结果显示,PPARα缺失明显增加了 CHOP和Cleaved caspase-3 的表达(P均0.05)。3.2.2上调PPARα减少严重内质网应激诱导的细胞凋亡严重ERS条件下,即TM或TG孵育细胞24小时,PPARα表达降低,细胞存活率明显下降,细胞上清中的LDH活性明显增加。应用PPARα激动剂Wy-14643预处理后,细胞存活率明显增加,LDH活性明显降低。Western Blot结果也显示与单用TM、TG处理的肝细胞相比,Wy-14643明显降低了 CHOP和Cleaved caspase-3的表达水平(P均0.05)。因此PPARα可能是不同程度ERS之间的重要调节点。结论:1激活PPARα通过抑制ERS及后续的肝细胞凋亡对ALF起保护作用。2抑制肝细胞ERS对ALF的保护作用是通过激活PPARα实现的。3轻度ERS促进PPARα的表达减少细胞凋亡,而严重的ERS抑制PPARα的表达促进细胞凋亡。4 PPARα在ERS进展中的调节作用是复杂的。PPARα可能是轻度ERS减少细胞凋亡与严重ERS促进细胞凋亡之间的调定点。5 PPARα可能成为临床防治ALF 一个新的治疗靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.3

【相似文献】