成年大鼠创伤性脑损伤后的皮质与海马内源性神经发生研究

发布时间：2018-04-25 17:54

  本文选题：创伤性脑损伤 + 神经发生　； 参考：《苏州大学》2014年博士论文

【摘要】：第一部分成年大鼠创伤性脑损伤后皮质的内源性神经发生 目的： 探讨成年大鼠创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）后大脑皮质内源性的神经发生及其影响因素。 方法： Ⅰ、体内实验 1. SD大鼠分为假手术（SHAM）组和TBI组，SHAM组大鼠只开颅，不制备脑损伤模型；TBI组大鼠采用颅脑液压损伤装置，制备创伤性脑损伤模型。 2. SD大鼠TBI后连续7d腹腔注射BrdU以标记新生的神经细胞。 3. TBI后1、3、7、14、28d应用免疫荧光法检测大鼠损伤区皮质nestin+/sox-2+神经前体细胞（neural progenitor cells, NPCs）、GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞、DCX+/BrdU+神经元前体细胞、MAP-2+/BrdU+新生神经元、NeuN+/BrdU+新生成熟神经元、GFAP+/BrdU+新生星形胶质细胞、CNP+/BrdU+新生少突胶质细胞的发生情况。 4. TBI后1、3、7、14、28d应用TUNEL/BrdU双标记技术检测大鼠损伤区皮质新生细胞的凋亡情况。 5. TBI后1、3、7、14、28d应用ELISA法检测大鼠损伤区皮质基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1, SDF-1）的表达水平。 6. TBI后1、3、7、14、28d应用高效液相色谱法（high performance liquidchromatography, HPLC）检测大鼠脑脊液中谷氨酸含量。 Ⅱ、体外实验 1.分离培养大鼠TBI后损伤区皮质内源性NSCs（neural stem cells, NSCs）并进行鉴定，BrdU/Nestin免疫荧光检测其胚源性及增殖能力，MAP-2、GFAP、CNP免疫荧光检测其多向分化潜能。 2.传至第二代的NSCs行谷氨酸受体NMDA主要功能亚基NR1免疫荧光标记，流式细胞分析NR1阳性细胞百分比。 3.传至第二代的NSCs分空白对照组（Control）、谷氨酸组（Glu）、Glu+MK-801（0h）组、Glu+MK-801（24h）组4组分化培养：Control组用DMEM/F12无血清培养基培养；Glu组在DMEM/F12无血清培养基中加入谷氨酸（5μM）培养；Glu+MK-801(0h)组在DMEM/F12无血清培养基中加入谷氨酸（5μM）培养同时加入NMDA受体拮抗剂MK-801（10μM）；Glu+MK-801（24h）组在DMEM/F12无血清培养基中加入谷氨酸（5μM）培养24h后加MK-801（10μM）继续培养；培养1、3、7、14d后行DCX、MAP-2免疫荧光检测NSCs向神经元分化情况，TUNEL法检测细胞凋亡情况。 4. Control组、Glu+MK-801（24h）组培养1、3、7、14d后，应用实时PCR检测NR1的mRNA表达情况，Western blot检测NR1的蛋白表达情况。 5.传至第二代的NSCs接种于Transwell培养体系的上室，分为空白对照（Control）组、TBI脑组织提取液（Extract）组、SDF-1组3组培养：Control组下室加入DMEM/F12无血清培养基；Extract组下室加入含有20μl/ml TBI脑损伤组织提取液的DMEM/F12无血清培养基；SDF-1组下室加入含有200ng/ml SDF-1的DMEM/F12无血清培养基。培养3d后行Hoechst33342染色检测细胞迁移情况，免疫荧光技术检测迁移细胞的趋化因子受体4（chemokine receptor4, CXCR4）表达情况。 结果： Ⅰ、体内实验 1.免疫荧光技术检测损伤区皮质神经发生结果：TBI后1、3、7、14d损伤区周围皮质出现nestin+/sox-2+NPCs以及GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞，并在3d时达到高峰而后下降，在相应时间点GFAP+/sox-2+放射状胶质样细胞数量少于nestin+/sox-2+NPCs。伤后1、3、7d观察到nestin+/sox-2+NPCs从室周带后区（posteriorperiventricular area, PPv）沿胼胝体向损伤区迁移；伤后3、7、14d损伤区皮质观察到DCX+/BrdU+神经元前体细胞，7d时达到高峰而后下降；仅在TBI后7、14d损伤区皮质观察到少量的MAP-2+/BrdU+新生神经元，在TBI后1、3、7、14、28d损伤区皮质均未观察到NeuN+/BrdU+新生成熟神经元；TBI后1、3、7、14、28d损伤区皮质均观察到GFAP+/BrdU+新生星形胶质细胞，7d时达到高峰并一直保持在较高水平；TBI后1、3、7、14、28d损伤区皮质均未观察到CNP+/BrdU+新生少突胶质细胞；在相应时间点，BrdU+细胞中星形胶质细胞多于NPCs和新生神经元。 2. TUNEL/BrdU双标记技术检测新生细胞的凋亡结果：TBI后1、3、7、14d损伤区周围皮质出现TUNEL+/BrdU+凋亡的新生细胞，TBI后7、14d时凋亡的新生细胞数量多于伤后1、3d，高峰在伤后7d，28d时几乎未见凋亡的新生细胞。 3. ELISA法检测损伤区皮质SDF-1的表达水平结果：TBI后1d大鼠损伤区皮质SDF-1表达开始升高，3d时达到高峰，而后逐渐下降，14、28d时已接近SHAM组水平。 4. HPLC检测脑脊液谷氨酸含量水平结果：TBI组大鼠脑脊液内谷氨酸的含量伤后1d即达到高峰，而后逐渐下降，14d时已接近SHAM组水平。 Ⅱ、体外实验 1.成年大鼠TBI后损伤区皮质内源性NSCs鉴定结果：损伤区皮质内分离培养出NSCs球为BrdU+/Nestin+，并能扩增传代，可以分化为MAP-2+神经元、GFAP+星形胶质细胞以及CNP+少突胶质细胞。 2.流式细胞分析NSCs的NR1表达结果：成年大鼠TBI后损伤区皮质内源性NSCs中，43±1.06%细胞的谷氨酸受体NMDA主要功能亚基NR1阳性。 3.谷氨酸对NSCs向神经元分化影响结果：培养1d时Glu组、Glu+MK-801（24h）组的DCX+神经元前体细胞明显多于Control、Glu+MK-801（0h）组；3d时Glu+MK-801（24h）组DCX+神经元前体细胞最多，Glu组DCX+神经元前体细胞数量有所下降，但多于Control、Glu+MK-801（0h）组；至7d时Glu+MK-801（24h）组DCX+神经元前体细胞仍较多，Glu组DCX+神经元前体细胞与Control、Glu+MK-801（0h）组比较差异无统计学意义；14d时4组几乎未见DCX+神经元前体细胞，MAP-2免疫荧光检测显示Glu+MK-801（24h）组MAP-2+神经元明显多于其它3组；TUNEL法检测结果显示，体外培养1d后,4组可见少量凋亡细胞，3、7、14d时Control、Glu+MK-801（0h）、Glu+MK-801（24h）组凋亡细胞数量与1d时比较几乎无变化，而Glu组TUNEL+凋亡细胞数量3d时达到高峰，7d、14d时略有下降但多于其它3组。 4.实时PCR检测NR1的mRNA表达情况结果：Glu+MK-801(24h)组NR1的mRNA相对表达量呈逐渐升高趋势，7d时达到高峰，除7、14d外，其它时间点两两比较差异有统计学意义；Control组NR1的mRNA相对表达量较低，各时间点差异无统计学意义；在相应时间点Glu+MK-801（24h）组NR1的mRNA相对表达量均高于Control组，差异均有统计学意义。 5. Western blot检测NR1的蛋白表达情况结果：Glu+MK-801(24h)组NR1的蛋白相对表达量呈逐渐升高趋势，7d时达到高峰，除7、14d外，其它时间点两两比较差异有统计学意义；Control组NR1的蛋白相对表达量较低，各时间点差异无统计学意义；在相应时间点Glu+MK-801（24h）组NR1的蛋白相对表达量均高于Control组，差异均有统计学意义。 6. Transwell迁移实验检测脑损伤组织提取液及SDF-1对细胞迁移影响的结果：Extract组和SDF-1组迁移的细胞数量明显高于Control组，差异有统计学意义；Extract组和SDF-1组迁移的细胞数量差异无统计学意义；3组迁移的细胞大部分呈现CXCR4阳性。 结论： 成年SD大鼠TBI后，损伤区皮质内出现NPCs，其一部分来源于局部激活的放射状胶质样细胞，，也有部分从PPv区沿胼胝体迁移而来，TBI后损伤区内高表达的SDF-1对其迁移起到了一定的作用；这些NPCs能够向神经元及星形胶质细胞分化，但前者未能最终发育为成熟的神经元，伤后损伤区内谷氨酸表达水平的增高既可以促进NPCs向神经元分化，但也可以促进分化过程中的神经元凋亡，后者与神经元在发育过程中NMDA受体表达的逐渐升高有关。 第二部分奥拉西坦对成年大鼠创伤性脑损伤后海马内源性神经发生的影响 目的： 探讨奥拉西坦对成年大鼠TBI后海马内源性神经发生的影响及其机制。 方法： Ⅰ、体内实验: 1.经水迷宫训练筛选出达标大鼠，分为空白对照组（Control）、生理盐水组（NS）、奥拉西坦组（Oxiracetam）3组：Control组只开颅，不制备脑损伤模型；NS组采用颅脑液压损伤装置制备TBI模型，TBI后连续14d定时每天一次尾静脉注射无菌生理盐水1ml；Oxiracetam组采用颅脑液压损伤装置制备TBI模型，TBI后连续14d定时每天一次尾静脉注射含有奥拉西坦（200mg/kg）的无菌生理盐水1ml。 2. TBI后第15d进行连续4d的定位巡航试验，第19d进行空间探索试验； 3. TBI后第20d应用DCX免疫荧光检测海马新生神经元情况，ChAT免疫荧光检测隔区及Meynert基底核胆碱能神经元情况。 4. TBI后第20d应用ATP检测试剂盒检测海马ATP含量。 5. TBI后第20d应用ELISA法检测海马乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）含量。 Ⅱ、体外实验： 1.从大鼠胚脑海马中分离培养NSCs并进行扩增，将传至第二代的NSCs接种于包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板内，分为空白对照组（Control）、生理盐水组（NS）、奥拉西坦组（Oxiracetam）3组： Control组加入DMEM/F12无血清培养基培养；NS组加入含有10μl/ml生理盐水的DMEM/F12无血清培养基培养；Oxiracetam组加入含有4mg/ml奥拉西坦的DMEM/F12无血清培养基培养，培养3d后行DCX免疫荧光检测NSCs向神经元分化情况,并收集细胞应用ATP检测试剂盒检测细胞内ATP含量。 2.取大鼠胚基底前脑原基制成单细胞悬液，在Transwell培养体系中分为空白对照组（Control）、胆碱能神经元组（Cholinergic neuron）、生理盐水+胆碱能神经元组（NS+Cholinergic neuron）、奥拉西坦+胆碱能神经元组（Oxiracetam+Cholinergicneuron）培养： Control组下室不接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液，只加入DMEM/F12无血清培养基；Cholinergic neuron组下室接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液并加入DMEM/F12无血清培养基培养；NS+Cholinergic neuron组下室接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液并加入含10μl/ml生理盐水的DMEM/F12无血清培养基培养；Oxiracetam+Cholinergic neuron组下室接种鼠胚基底前脑原基制备的单细胞悬液并加入含有4mg/ml奥拉西坦的DMEM/F12无血清培养基培养；将从大鼠胚脑海马中分离扩增的NSCs接种于Transwell培养体系的上室，共培养3d后，行ChAT免疫荧光检测下室胆碱能神经元分化情况、DCX免疫荧光检测上室海马NSCs向神经元分化情况，收集各组培养液用ELISA法检测ACh含量。 3.取大鼠胚基底前脑原基制成单细胞悬液，接种于包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔培养板内，分为空白对照组（Control）、生理盐水+TBI脑组织提取液组（NS+Extract）、奥拉西坦+TBI脑组织提取液组(Oxiracetam+Extract)，开始各组均用DMEM/F12无血清培养基培养。第4d换培养液时，Control组继续加入DMEM/F12无血清培养基；NS组加入含有20μl/ml脑损伤皮质提取液、10μl/ml生理盐水的DMEM/F12无血清培养基；Oxiracetam+Extract组加入含有20μl/ml脑损伤皮质提取液及4mg/ml奥拉西坦的DMEM/F12无血清培养基，再培养3d，然后行TUNEL法检测凋亡细胞。 结果： Ⅰ、体内实验 1.定位巡航试验结果：Oxiracetam组和Control组大鼠逃避潜伏期少于NS组，差异有统计学意义。 2.空间探索试验结果：Oxiracetam组和Control组大鼠平台跨越次数高于NS组，差异有统计学意义。 3. DCX免疫荧光检测海马齿状回神经元前体细胞结果：Oxiracetam组损伤侧齿状回内DCX+神经元前体细胞最多，NS组次之，Control组仅见到少量的DCX+的神经元前体细胞，差异有统计学意义。 4. ChAT免疫荧光检测隔区及Meynert基底核胆碱能神经元结果： Control组可见到较多的ChAT+胆碱能神经元，Oxiracetam组损伤侧隔区及Meynert基底核ChAT+胆碱能神经元虽有减少但多于NS组，差异有统计学意义。 5.海马ACh含量检测结果：Oxiracetam组海马ACh含量低于Control组，但高于NS组，差异有统计学意义。 6.海马ATP含量检测结果：Oxiracetam组海马ATP含量低于Control组，但高于NS组，差异有统计学意义。 Ⅱ、体外实验 1. DCX免疫荧光标记检测奥拉西坦对海马NSCs向神经元分化结果：Control组、NS组、Oxiracetam组均可见少量DCX+神经元前体细胞，各组间DCX+神经元前体细胞数量差异无统计学意义。 2. ATP检测试剂盒检测细胞ATP含量结果：Oxiracetam组ATP含量高于Control组和NS组，差异有统计学意义。 3. ChAT免疫荧光检测胆碱能神经元原代培养结果： Cholinergic neuron组、NS+Cholinergic neuron组、Oxiracetam+Cholinergic neuron组均可见较多的ChAT+胆碱能神经元，3组间胆碱能神经元数量差异无统计学意义，Oxiracetam+Cholinergic neuron组ChAT免疫荧光强度较强；Control组未见ChAT+细胞。 4. DCX免疫荧光检测胆碱能神经元对海马NSCs向神经元分化结果：Oxiracetam+Cholinergic neuron组的DCX+神经元前体细胞最多，Cholinergic neuron组、NS+Cholinergic neuron组的DCX+神经元前体细胞多于Control组，除Cholinergicneuron组和NS+Cholinergic neuron组外，其余两两比较均有统计学意义。 5. ELISA法检测培养液中ACh含量检测结果： Cholinergic neuron组、NS+Cholinergic neuron组、Oxiracetam+Cholinergic neuron组培养中均能检测到ACh，Oxiracetam+Cholinergic neuron组培养液中ACh含量高于其它2组；Control组未检测到ACh。 6. TUNEL试剂盒检测奥拉西坦对胆碱能神经元免于凋亡的保护作用结果：NS+Extract组可见到较多的凋亡细胞，Control组和Oxiracetam+Extract组只见到少量凋亡细胞，3组间凋亡细胞数量两两比较差异均有统计学意义。 结论： 奥拉西坦能够促进成年大鼠TBI后海马内源性的神经发生，明显改善TBI大鼠学习记忆认知功能障碍；奥拉西坦可以保护基底前脑胆碱能神经系统，促进胆碱能神经元ACh的分泌从而促进海马神经发生；此外，奥拉西坦还可以促进海马细胞ATP的产生，利于神经的发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15

【共引文献】

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本文编号：1802363