血循环miRNAS与急性心肌梗死和缺血性脑卒中相关联

发布时间：2018-05-26 05:00

本文选题：循环血miRNA + 生物标志物　；参考：《华中科技大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景：微小RNAs (miRNAs)是一类相对新的内源性非蛋白质编码小RNA分子,它们可以通过结合到mRNA的3’非编码区调控靶基因的表达。miRNAs已被证实在新陈代谢、细胞发育、分化、增殖和凋亡中发挥重要作用。然而,成熟miRNAs结合到靶mRNA的特定区域导致翻译抑制或mRNA降解机制并未完全清楚阐明。现有研究已经发现人类基因组编码超过1000个的miRNAs,其表达有一定的组织或细胞类型特异性。研究表明,miRNAs已经在广泛的人类疾病中观察到变化,包括自身免疫,炎症,神经变性和心血管疾病。在动物实验研究中,大量证据表明心脏特异性miRNA,如miR-1, miR-133a/b和miR-208等,参与调控心脏发育及影响心血管疾病,包括急性心肌梗死(AMI)。最近的研究表明,无论是在人类和动物,一些miRNAs存在于体循环中。已有报道显示一些循环miRNAs表达水平在怀孕期间和在多种癌症或心血管疾病存在差异性。心血管系统疾病中,急性心肌梗死具有发病急、高死亡率等特点,因此实现AMI的早期诊断将具有重要的临床价值。迄今,一些生物标志物已在诊断AMI中被应用,例如,心肌肌钙蛋白I (cTnI)、CK-MB等。但是,miRNAs在急性心肌梗死患者血浆中水平如何,是否可以提高诊断急性心肌梗死灵敏度或者特异性还较少研究。近来报道,冠状动脉病或糖尿病引起的心肌损伤可以引起多种miRNA (miR-1, miR-133, miR-499, miR-208)在血循环的表达水平发生改变。急性心肌梗死(AMI)是最严重的一种心血管疾病。早期,准确的诊断可以保证得到及时再灌注治疗因此可以明显减少死亡率。最近的研究表明,循环心肌源性的miRNAs可能是梗死的潜在生物标志物。最近有研究证明,在急性心肌梗死人和小鼠的血浆中miR-1, miR-133a/b,和miR-499-5p发生改变。这些结果表明miRNAs可参与心肌疾病的病理生理过程。然而,血循环miR-30a, miR-195, let-7b, miR-1和miR-126在急性心肌梗死的水平仍然是有待研究。因此,我们将探讨血循环中miR-30a, miR-195, let-7b, miR-1miR-126在急性心肌梗死发生过程中是否有显著的表达差异、是否与急性心肌梗死过程密切相关,以及作为实现对AMI早期诊断标志物的可能性。研究方法：(1)本项目2009年10月至2010年5月获得同济医院伦理委员会批准,在病人及家属签署了知情同意后执行。(2)入选急性心肌梗死患者18名,健康成人30名作为对照。AMI患者的血液样品在发病后4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时和1周分别采取外周静脉血5ml；健康对照组同样采血。离心法分离血浆并保持在-80℃直至RNA提取。(3)用TRIzol LS试剂提取总RNA；(4)用Real-Time PCR方法检测血浆miRNA水平,用2-△△ct法计算相对于miRNAs的表达水平。(5)用ELISA方法测定血浆cTnI的浓度。(6)所有的统计分析均采用统计软件SPSS13.0。独立样本T检验用于两个组进行比较。其中"g3组参数比较采用重复测量ANOVA分析。对于分类变量,卡方检验。miRNAs与心肌肌钙蛋白Ⅰ时间过程的趋势是由重复测量方差分析。用ROC曲线下面积(AUC)测量来判断miRNA诊断心肌梗死的特异性和敏感性。研究结果：(1)采用实时定量RT-PCR方法,我们分析了AMI患者和健康的成年人三种mi-RNAs (MIR-30A, miR-195和let-7b)的表达水平。结果显示,急性心肌梗死患者和健康成人后4小时后miR-30a, miR-195和let-7b的表达显著增高。在4小时,8小时和12小时,AMI患者血浆的miR-30a是对照组1.4倍,10.48倍和1.45倍。同样,AMI组与对照组相比,在8小时和12小时,miR-195表现出10.2倍和1.4倍增长。miR-30a和miR-195在急性心肌梗死的血浆水平在各时间点进行比较,在8小时达到达高峰。(2)与血浆cTnI的比较分析显示,在AMI患者中,miR-1, miR-126升高和cTnI显著相关,表现为相同的趋势。(3)我们引入ROC曲线以确定miRNA诊断急性心肌梗死的特异性和敏感性。由于miRNA的表达水平的检测可同时受技术和生物的变化的影响,我们用三个循环miRNA的组合的表达水平用一个单一的分数,称为复合体miRNA-得分,以提供一个改善信号。在8小时和12小复合的miRNA的平均得分在AMI组分别是2.93和2.96和对照组分别是1.53和1.56。该复合miRNA的分数来区分AMI组的能力,从对照组显示通过ROC曲线为AUC0.93和0.92。通过使用1.815和2.025阈值分数,进行了患者预测AMI,特异性为94%和90%,灵敏度为90%和90%。(4)这miR-1的分数和miR-126的分数代表了其在血浆的表达水平。在4小时,8小时,12小时,24小时,48小时和72小时,用miR-1的分数诊断急性心肌梗塞,其ROC曲线的AUC分别是0.92,0.90,0.94,0.92,0.96和0.90(图3和表2)。在AMI组,我们取得了灵敏度分别为93%,93%,94%,93%,93%和90%及特异性分别为90%,90%,93%,90%,90%和90%；miR-126的ROC曲线的AUC分别是0.86,0.87,0.88,0.87,0.84和0.83。AMI组,我们获得了特异性分别为78%,84%,88%,77%,80%,70%以及灵敏度分别为81%,81%,81%,81%,81%和81%。研究结论：我们的结果揭示血循环miR-30a, miR-195, let-7b, miR-1和miR-126表达水平的变化与经典的心肌标志物cTnI一致,与心肌梗死密切相关,因此具有用于诊断AMI的潜在临床价值。研究背景：在发达国家,中风是导致人们死亡和残疾的首要原因。其中,缺血性脑卒中约占中风患者的80%。.而在中国,每年有2500000人患缺血性脑卒中并且约1000000死于脑卒中。与冠心病类似,传统的脑卒中危险因素包括年龄、高血脂、高血压、糖尿病、吸烟、酗酒等。miRNA是小分子非蛋白编码RNA家族,通过调节mRNA的3’非翻译区来调节靶基因的表达。研究证实,miRNA参与大量病理生理进程,例如：发育、分化、增殖、凋亡、转移。然而,与肿瘤和心血管疾病相比,很少有研究报道miRNA与脑死亡、变性、或缺血性脑卒中之间的联系。近来研究发现,在果蝇Dicer酶的缺乏,可发生神经元的逐渐变性,而其靶基因miR-8则可以调节miRNA生成的关键环节,从而阻止神经元变性。此外,miR-146A/G等位基因也被证实和缺血性卒中相关。大鼠实验研究发现miR-195可通过抗淀粉样作用对慢性脑低灌注诱导的的老年性痴呆具有保护作用。 Jeya seelan等报道,miRNA可以参与调节SD大鼠大脑中动脉阻塞的病理生理机制。其研究发现在大脑中动脉阻塞24小时内实现再灌注,miR-30a-3p的表达是下调,而48小时再灌注,miR-30a-3p的表达则是上调。同时,最近研究表明miR-30家族可以调节血管的生成。此外,研究还发现在青年脑卒中的病人,miR-12表达水平出现明显的下调。在神经母细胞瘤细胞株,LIN28B和let-7这两种miRNA的表达与rs17065417的基因型相关。而其他研究发现Let-7可以激活Toll-like受体7有助于神经系统损伤的恢复。急性心肌梗塞和缺血性脑卒中有着类似的病理生理过程,我们前期的研究表明,血浆miRNA浓度可能是心肌梗死的潜在标志物。在心肌梗塞早期阶段我们检测血循环miR-30a, miR-126和let-7b的表达水平发生异常改变,对诊断急性心肌梗死病人有高度的特异性和敏感性。然而,miR-30a, miR-126和let-7b是否参与了缺血性脑卒中病理生理进程以及其表达水平是否也发生改变还未见报道。因此,我们将在本研究探讨miR-30a, miR-126和let-7b在缺血性脑卒中发生过程中是否有显著的表达差异,以及作为实现对缺血性脑卒中早期诊断的标志物的可能性。研究方法：(1)本项目在获得同济医院伦理委员会批准,病人及家属签署了知情同意书后执行。我们从同济医院分别收集缺血性脑卒中和健康对照合计247例样本,抽取5ml静脉血作为研究标本。本研究病例为脑梗死患者,诊断是根据国际经典诊断标准,影像学检查是由经验丰富的神经放射学专家确认。(2)用CT法分别计算并比较miRNA的相对表达水平。为了避免所提取RNA量存在差异,使用小核RNA(U6)作为内参来对miRNA表达水平进行统一标准化。(3)相对miRNA的表达水平用2-△△CT法进行计算。独立样本T检验用于两个组进行比较。对于分类变量采用卡方检验。一种复合得分(表示为miRNA表达水平总得分)定义来表示所述miRNA的累积水平。所述miRNA-得分分别为所有病例对照组内样品的miRNA表达水平的总和。所述miRNA的复合得分,并通过减去一个常数(最小得分)调整,以使所有分数中的最小值为0。并用ROC曲线(AUC)下面积作为判断miRNA诊断脑梗死的特异性和敏感性的统计工具。所有的统计检验都采用P0.05(95%CI)作为统计学显著差异水准。所有统计分析使用统计软件SPSS13.0(Statistical Package for the Social Sciences,Chicago,111), 研究结果：(1)miRNA在缺血性脑卒中的表达水平：我们分别测量miR-30a,miR-126和let-7b在缺血性脑卒中和健康对照组的表达水平。研究发现miR-30a,miR-126和let-7b在48周和对照组没有明显差异,而在24小时,1周,4周和24周,同对照组相比,缺血性脑卒中患者miR-30a, miR-126表达下调。在24小时、1周、4周和24周,miR-30a在所有缺血性脑卒中组比对照组低45%-79%,而miR-26在所有缺血性脑卒中组比对照组低85%-98%。值得注意是我们的数据显示let-7b在缺血性脑卒中患者血循环的表达水平在不同脑卒中亚型中并不相同。 (2) miRNA的特异性和敏感性：由于miRNA的表达可能会受技术和其他因素的影响,不同亚型的脑卒中所测定miRNA在同一时间点用一个分数来定义可能会因此具有不同偏差缺乏稳定性。我们用miRNA分数代表let-7b-SA, let-7b-CEmb和let-7b-UDN的累计水平。与对照组比较,缺血性脑卒中的miRNA分数具有显著的统计学差异。为了确定miRNA诊断脑卒中的特异性和敏感性,我们引入ROC曲线进行分析研究。在24小时,1周,4周和24周,miR-30a的ROC的AUC分别是0.91(95%CI=0.869-0.979),0.91(95%CI=0.848-0.971),0.92(95%CI=0.856-0.976)和0.93(95%CI=0.875-0.984)。我们得到敏感性分别为94%,93%,90%,而特异性分别是80%,84%,84%和84%。MiR-126的ROC的AUC分别是0.92(95%CI=0.871-0.978),0.94(95%CI=0.895-0.985),0.93(95%CI=0.878-0.982)和0.92(95%CI=0.864-0.977)。诊断缺血性脑卒中的敏感性分别是92%,90%,92%和92%,特异性分别是84%,86%,84%和82%。Let-7b的ROC的AUC分别是0.93(95%CI=0.879-0.980),0.92(95%CI=0.866-0.98),0.92(95%CI=0.858-0.98)和0.91(95%CI=0.849-0.97)。因此用于诊断缺血性脑卒中的敏感性分别是92%,90%,92%和89%,特异性分别是84%,84%,86%和80%。结论：缺血性脑卒中患者血循环miR-30a, miR-126和let-7b表达水平发生显著的异常改变,提示miR-30a, miR-126和let-7可能具有作为诊断缺血性脑卒生物标志物的潜在临床价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R542.22

【参考文献】