Resolvin D1对脓毒症小鼠免疫功能的影响及机制研究

发布时间：2018-07-01 17:35

  本文选题：脓毒症 + 消退素　； 参考：《第二军医大学》2014年博士论文

【摘要】：【研究目的】 脓毒症（sepsis）是感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS），其病理基础是病原体诱发的炎症反应过度激活以及后期的炎症反应紊乱或免疫抑制，病理生理过程极其复杂，牵涉到多个脏器和系统、多类细胞以及多种信号传导通路。巨噬细胞在脓毒症各阶段中均具有非常重要的作用。 消退素D1（resolvin D1，RvD1）是由二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）中合成的一种强效的抗炎促吸收脂类调节子，其可通过受体依赖机制调节巨噬细胞吞噬功能。本课题拟在小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）模型中观察RvD1对脓毒症小鼠免疫功能的影响，并在体外培养的小鼠巨噬细胞中初步探索RvD1的作用机制。 【研究方法】 1、采用盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）致脓毒症小鼠模型。32只C57BL/6小鼠接受CLP手术后随机分成两组，分别于手术后即刻接受尾静脉注射RvD1（100ng/只）或者等量安慰剂处理，观察小鼠8天生存率。 2、将16只C57BL/6小鼠随机分成假手术组（SHAM，n=4），盲肠结扎穿孔模型组（CLP，n=6）和RvD1处理组（CLP+RvD1，n=6）。CLP模型后24h收集各组小鼠肺脏组织、外周血血浆、腹腔灌洗液、脾脏及胸腺。HE染色观察各组小鼠肺组织病理变化；营养琼脂培养板法检测小鼠血及腹腔细菌菌落形成单位（CFUs），比较各组小鼠血及腹腔细菌清除率；ELISA法检测小鼠外周血细胞因子TNFα、IFN γ、IL 6、IL 10水平；流式细胞仪计数外周血和腹腔灌洗液中性粒细胞数目、外周血单核细胞（PBMC）数目以及脾脏巨噬细胞和淋巴细胞数目；流式细胞仪检测各组小鼠胸腺CD3+T淋巴细胞凋亡率。 3、将15只C57BL/6小鼠随机分成假手术组（SHAM，n=3），盲肠结扎穿孔模型组（CLP，n=3），余下9只小鼠接受盲肠结扎穿孔手术后分别接受不同剂量RvD1（1ng、10ng、100ng）尾静脉注射处理。CLP术后24h时Western blot法检测各组肺组织磷酸化NF κB和总的NF κB水平。 4、将9只C57BL/6小鼠随机分成假手术组（SHAM，n=3），盲肠结扎穿孔模型组（CLP，n=6）。CLP模型后6h（n=3）和24h（n=3）收集各组小鼠肺脏，提取肺组织RNA，RT-PCR法检测各组NLRP3炎性体表达变化。将12只C57BL/6小鼠随机分成假手术组（SHAM，n=3），盲肠结扎穿孔模型组（CLP，n=3），ResolvinD1低剂量组（10ng，n=3）和Resolvin D1高剂量组（100ng，n=3）。CLP模型后24h收集各组小鼠肺脏，Western blot法检测各组NLRP3及NF-κB表达变化。 5、将12只C57BL/6小鼠随机分成假手术组（SHAM，n=3），盲肠结扎穿孔模型组（CLP，n=3），Resolvin D1低剂量组（10ng，n=3）和Resolvin D1高剂量组（100ng，n=3）。CLP模型后24h收集各组小鼠外周血，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞。Western blot法检测各组NLRP3表达变化。 6、体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，用LPS预刺激小鼠腹腔巨噬细胞后再用ATP（1mM）刺激，构建NLRP3炎性体活化的体外模型。在LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞之前应用RvD1（10ng/ml）预处理或者在LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞之后应用RvD1（10ng/ml）后处理，Western blot法检测各组NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表达变化。 7、体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，，用LPS预刺激小鼠腹腔巨噬细胞后再用ATP（1mM）刺激，构建NLRP3炎性体活化的体外模型。在LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞之后应用不同剂量的RvD1（1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml）处理小鼠腹腔巨噬细胞，Western blot法检测各组NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表达变化。 8、体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，用LPS预刺激小鼠腹腔巨噬细胞后用RvD1（10ng/ml）处理，之后应用ATP（1mM）或者不用ATP进一步刺激小鼠腹腔巨噬细胞，Western blot法检测各组NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表达变化，RT PCR法检测各组NLRP3表达变化。 9、体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，用LPS预刺激小鼠腹腔巨噬细胞后，在细胞培养液中加入氯化钾（KCl，75mM）或氯化钠（NaCl，75mM），之后用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）处理，Western blot法检测各组NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表达变化，ELISA法检测细胞上清中IL 1β水平。 10、体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，用LPS预刺激小鼠腹腔巨噬细胞后，在细胞培养液中加入抗氧化剂N 乙酰半胱氨酸（NAC，N acetylcysteine，10μM），之后用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）处理，Western blot法检测各组NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表达变化，ELISA法检测细胞上清中IL 1β水平。 11、体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，用LPS预刺激小鼠腹腔巨噬细胞后，在细胞培养液中加入组织蛋白酶B抑制剂（CA 074 Me，10μM），之后用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）处理，Western blot法检测各组NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表达变化，ELISA法检测细胞上清中IL 1β水平。 12、体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，用LPS预刺激小鼠腹腔巨噬细胞后，在细胞培养液中加入胞吞抑制剂细胞松弛素D（cytochalasin D，5μM），之后用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）处理，Western blot法检测各组NLRP3，caspase 1（40kd，20kd）表达变化，ELISA法检测细胞上清中IL 1β水平。 13、体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，应用si RNA干扰NLRP3表达，然后用RvD1（10ng/ml）处理，观察RvD1对巨噬细胞吞噬功能的作用。 14、体外分离培养小鼠腹腔巨噬细胞，用LPS预刺激小鼠腹腔巨噬细胞后，用RvD1（10ng/ml）和ATP（1mM）处理， CCK8细胞计数法检测生存巨噬细胞数目，流式细胞仪检测凋亡巨噬细胞比率。 【研究结果】 1、与对照组相比，尾静脉注射RvD1可显著提高盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture, CLP）致脓毒症小鼠8天生存率（P0.05）。 2、 RvD1尾静脉注射处理可减轻CLP模型后24hCLP小鼠肺脏组织病理损伤程度；显著减少CLP模型后24hCLP小鼠血及腹腔细菌含量；CLP模型后24h，小鼠外周血细胞因子TNFα、IFN γ、IL 6、IL 10水平显著升高，Resolvin D1处理可降低CLP小鼠外周血TNFα、IFN γ、IL 6、IL 10水平；RvD1尾静脉注射处理CLP模型小鼠24h小鼠腹腔中性粒细胞数目显著减少，但小鼠外周血中性粒细胞数目、单核细胞数目以及小鼠脾脏巨噬细胞和淋巴细胞数目无明显变化；RvD1尾静脉注射处理可显著减轻CLP模型后24hCLP小鼠胸腺CD3+T淋巴细胞凋亡率。 3、 CLP模型后24h小鼠肺组织磷酸化NF κB明显活化，Resolvin D1尾静脉注射处理可以剂量依赖性地抑制NF κB活化。 4、 CLP模型后6h各组小鼠肺脏NLRP3炎性体mRNA表达水平明显升高，Resolvin D1尾静脉注射处理可剂量依赖性地抑制NLRP3炎性体表达。 5、CLP模型后6h，Resolvin D1尾静脉注射处理可剂量依赖性地增强小鼠外周血单核细胞NLRP3炎性体表达。 6、Resolvin D1（10ng/ml）预处理小鼠腹腔巨噬细胞可抑制NLRP3炎性体各组件表达，而在LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞之后应用Resolvin D1（10ng/ml）后处理小鼠腹腔巨噬细胞可增强NLRP3炎性体各组件的表达。 7、在LPS刺激小鼠腹腔培养巨噬细胞之后应用Resolvin D1后处理小鼠腹腔巨噬细胞，能剂量依赖性地增强NLRP3炎性体各组件的表达。 8、在LPS刺激小鼠腹腔培养巨噬细胞之后应用Resolvin D1后处理小鼠腹腔巨噬细胞，可以在无NLRP3炎性体直接激动剂ATP存在的情况下激活NLRP3炎性体。 9、在体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中，细胞外高浓度氯化钾可抑制细胞内的钾离子外流，降低Resolvin D1对小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎性体激活作用。 10、在体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中，抗氧化剂N 乙酰半胱氨酸（NAC，N acetylcysteine，10μM）能降低Resolvin D1对小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎性体激活作用。 11、在体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中，组织蛋白酶B抑制剂（CA 074 Me，10μM）能降低Resolvin D1对小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎性体激活作用。 12、在体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞中，胞吞抑制剂细胞松弛素D（cytochalasin D，5μM）不能降低Resolvin D1对小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎性体激活作用。 13、 si RNA干扰NLRP3表达后，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力下降， RvD1（10ng/ml）处理可增强巨噬细胞吞噬功能。 14、应用Resolvin D1处理体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞，生存的巨噬细胞数目以及凋亡巨噬细胞比率无变化。 【结论】 Resolvin D1在盲肠结扎穿孔（CLP）模型致脓毒症（Sepsis）小鼠中可减轻小鼠全身炎症反应，并且增强小鼠对病原微生物的清除率，从而提高脓毒症小鼠的生存率。Resolvin D1增强小鼠对病原微生物的清除作用可能与其能激活小鼠腹腔单核巨噬细胞NLRP3炎性体有关，Resolvin D1对小鼠腹腔单核巨噬细胞NLRP3炎性体的激活作用可能与细胞内钾离子外流以及线粒体相关活性氧产生相关。
[Abstract]:Purpose of research

sepsis ( sepsis ) is a systemic inflammatory response syndrome caused by infection , the pathological basis of which is that pathogen - induced inflammatory response is over - activated and post - inflammatory response disorder or immunosuppression , and the pathological process is extremely complex , involving multiple organs and systems , multi - type cells and various signal transduction pathways .

In this study , the effect of RvD1 on the immune function of sepsis mice was investigated by receptor - dependent mechanism , and the mechanism of RvD1 was determined in mouse macrophages cultured in vitro .

Methodology of research

Methods Thirty - two C57BL / 6 mice were randomly divided into two groups after CLP operation . RvD1 ( 100 ng / L ) or equivalent placebo were given immediately after operation , and the 8 - day survival rate was observed .

2 . Sixteen C57BL / 6 mice were randomly divided into sham operation group ( SHAM , n = 4 ) , cecal ligation perforation model group ( CLP , n = 6 ) and RvD1 treatment group ( CLP + RvD1 , n = 6 ) . The lung tissues , peripheral blood plasma , peritoneal lavage fluid , spleen and thymus were collected 24 hours after CLP , and the pathological changes of lung tissues in each group were observed by HE staining .
The bacterial colony forming unit ( CFUs ) of mouse blood and abdominal cavity was detected by nutrition agar culture plate method , and the blood and abdominal bacterial clearance of each group were compared .
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本文编号：2088545