NKCC1在TBI损伤中的作用及其与Homer1a相互关系的研究

发布时间：2018-10-04 20:25

【摘要】：创伤性脑损伤是导致人们致残的一个主要原因。在颅脑外伤后，脑组织会经历初级损伤和二次脑损伤。二次脑损伤在颅脑损伤后发挥着重要的作用。目前很多研究证实，脂质过氧化介质释放，细胞凋亡和自由基的产生，都参与了脑外伤后继发性脑损害的病理机制,很多关键分子参与了TBI的机制。 NKCC1为细胞膜上的一种水通道蛋白，在维持细胞稳态方面发挥重要的作用。最近的研究表明NKCC1参与调节了脑部疾病中很多细胞和分子的功能。然而，NKCC1在创伤性脑损伤的作用机制尚不清楚。Homer1a为即早基因（IEG）的一种，在阿尔茨海默氏症、帕金森氏病、创伤性脑损伤（TBI）等疾病中起着至关重要的作用。此外，最新的研究证实，Homer1a在创伤性脑损伤中起到神经保护的作用。因此，我的研究的目的是探索NKCC1在创伤性脑损伤中的作用以及它与内源性Homer1a之间的相互作用。实验一：离体神经元机械性损伤模型的建立目的：为了模仿离体创伤性脑外伤，我们建立了一个可靠并且有效的离体小鼠皮层神经元机械性损伤模型。方法：这种模型通过用消毒过的21号枪头在培养皿上平行划伤培养神经元，从而达到模拟体外创伤性脑外伤的效果。通过对神经元细胞形态的改变的观察，乳酸脱氢酶（LDH）的释放以及末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记法（TUNEL）来观察神经元机械性划伤后的改变。结果：离体培养的神经元核成圆形或椭圆形，核仁大并且清晰。在显微镜下可以清晰的观察到神经元核仁和核膜。神经元机械性划伤后24h，细胞上清液中的乳酸脱氢酶（LDH）升高明显，于此同时末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记法（TUNEL）结果显示，机械性损伤后神经元划伤两侧出现显著地凋亡。结论：这种离体神经元机械性损伤模型简单并且可靠，可以很好的模拟体外创伤性脑损伤，为研究创伤性脑损伤提供了良好的研究方法。实验二：重物下落装置致体内创伤性脑损伤模型的建立目的：为了进一步研究小鼠创伤性脑损伤的病理生理机制，更好的模拟创伤性脑损伤的发生和发展，我们建立了一个非常可靠并且实用的模型。方法：这种模型是在Mamarou模型的基础上改进的。我们通过脑干湿重方法检测创伤性脑损伤后小鼠脑含水量的改变，，HE染色观察小鼠大脑皮层损伤情况，利用TUNEL法观察小鼠大脑皮层损伤后凋亡的情况。结果：损伤后小鼠大脑12h和24h的脑含水量比正常组高，；HE染色发现在皮层和海马损伤区域边缘，损伤组较正常组小鼠大脑皮层神经细胞排列紊乱，数量明显减少，空泡增多，一些细胞出现核固缩，碎裂TUNEL12h染色结果显示，在脑外伤区域可以发现大量的TUNEL阳性细胞。结论：这种重物下落引起的体内小鼠创伤性脑损伤模型操作简单，模型稳定性高。实验三：NKCC1和Homer1a在创伤性脑损伤后的表达变化规律目的：为了观察NKCC1和Homer1a在体内和体外创伤性脑损伤后的表达变化规律。方法：利用聚合酶链（PCR）反应和采用免疫印迹（WesternBlot）来分别观察NKCC1和Homer1a的mRNA和蛋白的表达变化规律；利用双重免疫荧光染色观察二者的在皮层和海马的共定位情况。结果：离体实验发现，NKCC1mRNA和蛋白在机械性损伤后表达随着损伤时间表达升高，1h达到最高点，随后表达逐渐下降；Homer1a蛋白在机械性损伤后随着损伤时间表达升高，6h达到最高点，随后表达逐渐下降；双重免疫荧光染色结果显示，体内创伤性脑损伤12h，NKCC1和Homer1a在小鼠皮层和海马组织中存在着共定位。结论：创伤性脑损伤后NKCC1和Homer1a都出现显著增加，免疫荧光染色结果提示，创伤性脑损伤后NKCC1和Homer1a出现共定位情况，可能提示它们在创伤性脑损伤后发挥相互调控的重要作用。实验四：创伤性脑损伤后NKCC1和Homer1a以及ERK的相互作用关系目的：为了研究创伤性脑损伤后NKCC1和Homer1a以及ERK的相互调控作用。方法：利用NKCC1的抑制剂布美他尼以及si-RNA降低NKCC1的活性，利用脑干湿重，蛋白免疫印迹，TUNNEL，LDH方法。结果：与对照组相比布美他尼可以显著抑制离体神经元LDH的释放，TUNEL染色提示布美他尼和NKCC1si-RNA可以显著降低神经细胞凋亡。体内试验发现，布美他尼可以降低小鼠大脑脑含水量，减轻脑水肿，降低皮层组织神经细胞的凋亡。体内和体外试验均发现，与对照组和空载体相比，抑制NKCC1的活性可以升高Homer1a蛋白的表达，并降低p-ERK蛋白的表达。结论：NKCC1在创伤性脑损伤后发挥着神经损害的作用，NKCC1的抑制剂以及si-RNA可以起到神经保护作用。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R651.15

【参考文献】