电离辐射小鼠皮肤伤口愈合延迟的分子机制研究

发布时间：2018-10-12 10:04

【摘要】：研究背景：创伤愈合是一个复杂的生物学过程，包括凝血、炎症，组织的增生，组织改建与重塑三个阶段[1]；而细胞因子在愈合的整个过程中均发挥着重要的作用，急性创伤时，细胞因子能够发挥正常功能参与愈合过程，最终使皮肤屏障功能得到重建；而在慢性伤口中，炎症细胞持续浸润导致伤口部位的蛋白水解环境改变，相关细胞因子被降解，使其未能发挥应有的功能，从而抑制了正常伤口的愈合过程。全身电离辐射(ionizingradiation，IR)作为一种特殊的损伤，其可以引起造血细胞和修复细胞数量的减少与功能的减退，影响并损害愈合过程中的诸多环节，从而导致创面愈合延缓。此外，当IR损伤伴有烧伤、各种创伤等合并损伤时，导致最终形成电离辐射合并损伤（radiationcombined injury, RCI）[2]。当前研究发现，该类伤口的愈合过程中可能存在细胞因子表达异常，而适量的、合理的运用细胞因子可以促进RCI的愈合，这不仅有利于组织的修复，而且可以提高伤口修复的质量。目前，尽管局部使用细胞因子促进创伤愈合的方法有很多，但是在细胞因子的选择及细胞因子的剂量上存在不同的观点。此外，由于RCI属于慢性损伤，在临床治疗中十分常见，如恶性肿瘤放疗引起的皮肤溃疡或放疗后手术伤口，RCI存在伤口时，炎症细胞的持续浸润会导致伤口处形成蛋白水解酶的环境，外源性的细胞因子极易被降解，难以发挥促进伤口愈合的作用。因此，选择合适的细胞因子、剂量和外源性细胞因子体内递送方式，对促进RCI伤口愈合有着十分重要的意义。细胞因子是能在细胞间传递信息并且具有明显免疫调控和效应功能的一类小分子生物活性多肽或糖蛋白[3]。细胞因子具有多效性、拮抗性、重叠性和协同性，它们相互作用调节创伤修复过程中的多种细胞反应，对细胞增殖、迁移、细胞外基质合成、分泌都具有重要的调控作用。当前研究表明，血管内皮生长因子-A(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF-A)、血小板源性生长因子-BB(Platelet-derivedGrowth Factor，PDGF-BB)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF）等均是创伤愈合过程中重要的细胞因子，在伤口愈合的不同时期有着不同的表达水平[4]，但是当前对于这些细胞因子在RCI伤口中表达水平的研究较少；GM-CSF作为其中一个重要的细胞因子，参与整个的创伤愈合过程，在创面愈合的炎症阶段它通过增加中性粒细胞的数量与功能而促进创面的炎症反应；在血管形成过程中能够促进内皮细胞迁移与增殖；还可以直接或通过IL-6间接作用角质形成细胞，刺激角质形成细胞增殖，促进再上皮化过程。在已有的糖尿病引发的慢性伤口治疗研究中发现，局部GM-CSF治疗可以有效促进慢性伤口的愈合，认为其可能成为将来治疗慢性伤口的一种新的治疗手段。目前缺乏GM-CSF治疗RIC的研究报告。第一部分：电离辐射损伤小鼠背部皮肤伤口愈合过程中多种细胞因子表达的观察目的：通过检测IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口中VEGF-A、PDGF-BB、TNF-α、GM-CSF的分子与蛋白水平的动态表达，从而探讨各种细胞因子对IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口愈合的影响。方法：在6Gy60Co γ全身电离辐射小鼠背部制作1.5×1.5cm的皮肤缺损，建立IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口模型，分别在致伤后的1d、3d、5d、7d取伤口皮肤组织，通过Real time-PCR方法检测VEGF-A、PDGF-BB、TNF-α、GM-CSF mRNA的动态表达水平，应用免疫组化的方法检测各种细胞因子蛋白表达情况。结果： Real time-PCR结果显示：比较IR损伤组与正常对照组伤口愈合过程中伤口局部组织中VEGF-A、PDGF-BB、TNF-α、GM-CSF四个细胞因子mRNA的表达水平，IR损伤组存在明显的表达异常，在伤后不同时间点上PDGF-BB mRNA的表达均低于对照组，第3天时两组表达差异较大（P0.01），提示在IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口愈合过程中存在PDGF-BB表达水平降低；在第3天时，IR损伤组VEGF-AmRNA的表达明显低于对照组（P0.05）,在第5天时对照组与IR损伤组均达到峰值，但IR损伤组表达低于于对照组，到第7天时对照组VEGF-A迅速下调，IR损伤组VEGF-A的表达高于对照组（P0.01），提示提示IR会导致伤口组织VEGF-A mRNA表达滞后；伤后7天中，IR损伤组TNF-α mRNA表达均高于对照组，在第7天时，IR损伤组mRNA表达明显高于对照组（P0.01），，提示在IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口愈合过程中存在TNF-α过表达介导的异常炎症反应；在伤后第1、3、5天，IR损伤组GM-CSF mRNA的表达水均明显低于对照组（P0.01），在伤后的第7天随着对照组GM-CSF mRNA表达水平的下调，二者之间无明显差异，提示IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口愈合的迟滞与IR损伤造成伤口局部GM-CSF的低表达有关。同样，免疫组化结果表明VEGF-A、PDGF-BB、TNF-α、GM-CSF蛋白的表达变化趋势与mRNA表达变化趋势相吻合。结论：IR损伤可以造成皮肤缺损伤口局部多种细胞因子表达紊乱，其中包括生长因子表达的延迟及降低，直接抑制肉芽组织增生、血管生成；炎症细胞因子表达紊乱造成炎症发育延迟，周期延长。细胞因子表达紊乱既是IR的结果，也是导致RCI伤口愈合延迟的原因。第二部分：不同剂量rhGM-CSF壳聚糖-胶原蛋白水凝胶在IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口愈合过程中的疗效评价目的：探讨不同剂量的rhGM-CSF（1500ng/ml,6000ng/ml及10000ng/ml）壳聚糖-胶原蛋白水凝胶对IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口愈合过程中的影响作用，进而寻找其最适的作用剂量。方法：我们在第一部分的实验研究基础上选择rhGM-CSF作为体内介入药物，分别在IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口使用不同剂量的rhGM-CSF （1500ng/ml、6000ng/ml和10000ng/ml）壳聚糖-胶原蛋白水凝胶，连续局部给药5天，1次/天，以局部使用不含rhGM-CSF的壳聚糖-胶原蛋白水凝胶的为对照，然后进行伤口愈合评价和相关细胞因子表达检测。其中包括：①伤口愈合评价：动态描记实验治疗组与对照组伤口残余面积，运用Image Pro plus v1.5软件系统对描记图像进行分析，测量伤口愈合过程中皮肤缺损区残余面积比的变化；用Masson染色法检测伤后第14天皮肤伤口胶原纤维的含量；②相关内源性细胞因子表达检测：皮肤伤口取材组，IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口局部使用rhGM-CSF（10000ng/ml）凝胶后，通过Real time-PCR检测创口组织PDGF-BB、VEGF-A、TNF-α的mRNA表达水平。分析不同剂量的GM-CSF在IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口愈合过程的影响，进而寻找其最适本研究模型条件下的治疗剂量。结果：①在IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口伤后第14天时，rhGM-CSF1500ng/ml、rhGM-CSF6000ng/ml不同剂量的实验治疗组与空白对照组相比，小鼠背部残余面积比均小于空白对照组（P0.01），而rhGM-CSF10000ng/ml剂量的实验组的残余面积比却大于空白对照组（P0.05）；结果还显示在前7天6000ng/ml剂量rhGM-CSF凝胶治疗组比1500ng/ml剂量rhGM-CSF凝胶治疗组起效快；提示局部给予外源性的rhGM-CSF凝胶可以明显改善IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口的愈合过程，且在一定剂量范围内其浓度与治疗功效成正比（rhGM-CSF6000ng/ml凝胶组优于rhGM-CSF1500ng/ml），但当rhGM-CSF剂量为10000ng/ml时，伤口愈合反而受到抑制；Masson染色法检测伤后第14天皮肤伤口胶原纤维的含量结果：在IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口使用不同剂量的rhGM-CSF （1500ng/ml、6000ng/ml和10000ng/ml）凝胶后，rhGM-CSF6000ng/ml凝胶组明显优于其他三组，胶原着色深，面积分布较为广泛，排列紧密。②相关内源性细胞因子表达检测结果：在IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口使用rhGM-CSF剂量为10000ng/ml时，1d、3d、5d、7d Real time-PCR结果显示VEGF-A、PDGF-BB细胞因子的表达实验组均低于对照组，提示在IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口使用剂量rhGM-CSF10000ng/ml的凝胶，会不同程度抑制其他细胞因子的表达。结论：细胞因子是调节RCI伤口愈合的关键因素，外源性GM-CSF伤口局部运用可以明显影响RCI伤口愈合过程。本研究结果显示：局部给予外源性的rhGM-CSF壳聚糖-胶原蛋白水凝胶可以明显改善IR损伤小鼠背部皮肤缺损伤口的愈合过程，且在一定剂量范围内其浓度与治疗功效成正比（rhGM-CSF6000ng/ml凝胶组优于rhGM-CSF1500ng/ml凝胶组）。就促进伤口愈合而言，外源性GM-CSF的给药浓度应控制在一定的范围内，这个范围与伤口类型、给药方式相关。具体在本研究模型条件下，GM-CSF的最佳浓度及剂量仍待进一步研究验证。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R641

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