大鼠AOC3基因在重症失血性休克及复苏中的表达与功能

发布时间：2018-10-29 11:22

【摘要】：【背景】尽管对休克的复苏、救治已有三百余年的研究历史，但面对重症失血性休克时使用传统治疗方法仍然效果不佳、死亡率高。重症失血性休克的病理生理学特点是：微循环持续低灌流和顽固性低血压。如何找到新的治疗位点以改善这两个病理生理改变是治疗重症休克的关键。本实验小组前期对重症失血性休克大鼠的肝脏中的差异基因进行分析，发现在经历了相同条件的重症失血性休克后，存活与死亡的大鼠肝脏中AOC3基因水平差异明显。含铜胺氧化酶3（AOC3）基因编码的蛋白质被称为血管粘附蛋白-1（VAP-1），VAP-1抗原的克隆揭示其属于氨基脲敏感性胺氧化酶（SSAO）。VAP-1具有双重功能，作为粘附分子其能在炎症下诱导白细胞与血管内皮细胞间的粘附，作为胞外酶又可对伯胺类物质进行氧化脱胺反应。既往研究表明VAP-1在白细胞渗出、粘附级联反应、糖代谢调节、血管损伤等方面都具有重要意义。但AOC3基因与失血性休克之间的关系尚未见报道。【目的】 1、明确重症失血性休克及复苏过程中大鼠小肠及血清中AOC3基因及其编码蛋白VAP-1的表达和酶活性变化； 2、明确缺氧条件下大鼠肠微血管内皮细胞（RIMEC）中AOC3基因及其编码蛋白VAP-1的表达及诱导白细胞粘附功能的变化； 3、明确抑制VAP-1/SSAO活性对缺氧条件下RIMEC中VAP-1诱导白细胞粘附功能的影响； 4、明确抑制VAP-1/SSAO活性对重症失血性休克及复苏后的大鼠小肠微循环及粘膜损伤和大鼠24小时生存率的影响。【方法】 1、建立重症失血性休克及复苏大鼠模型（股动脉2.0ml/kg min匀速放血，维持35-45mmHg休克血压1小时，1/2总失血量的血液＋3/2总失血量的乳酸林格氏液复苏），采集休克前、休克1小时后、复苏1小时后的小肠组织及血清； 2、采用realtime RT-PCR测量小肠组织中的AOC3基因的mRNA值，Western blot测量小肠组织中的VAP-1含量，免疫组化检测小肠组织中VAP-1的表达，ELISA试剂盒法测量血清中可溶性VAP-1（sVAP-1）的含量和VAP-1/SSAO活性； 3、制备AOC3过表达腺病毒并将其转染RIMEC，realtime RT-PCR、Western Blot分别检测常氧及缺氧条件（95%N2和5%CO2培养24小时）下、正常及腺病毒转染后的RIMEC中AOC3基因及VAP-1的水平； 4、使用白细胞-内皮细胞粘附试剂盒分别检测正常及加入SSAO抑制剂（1mg/ml2-溴乙胺）、常氧及缺氧条件下、正常及腺病毒转染后的RIMEC与大鼠白细胞粘附情况； 5、复制重症失血性休克及复苏大鼠模型，复苏时加用不同浓度（20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg）的2-溴乙胺或等体积的生理盐水，比较复苏1小时后各组血清中VAP-1/SSAO活性； 6、复制重症失血性休克及复苏大鼠模型，复苏时实验组加用20mg/kg2-溴乙胺，比较实验组和生理盐水对照组中复苏1小时及24小时后的血压，活体显微镜检测复苏1小时后小肠微循环情况（微血管管径及毛细血管流速），检测复苏24小时后小肠粘膜损伤情况（Chiu’s评分）和小肠粘膜上皮细胞凋亡情况（TUNEL检测），比较大鼠24小时生存率。【结果】 1、重症失血性休克时小肠组织AOC3基因的mRNA值、VAP-1蛋白水平以及血清sVAP-1水平、VAP-1/SSAO活性均较假休克组显著升高（P值均0.001），复苏后上述各值较休克组下降，但仍显著高于假手术组，小肠组织免疫组化显示VAP-1主要表达于小肠微血管内皮细胞及平滑肌细胞的胞浆中； 2、缺氧条件下RIMEC中AOC3基因的mRNA值较常氧条件下显著升高（P0.001），且在AOC3基因腺病毒转染后的RIMEC中升高更明显（P0.001），VAP-1蛋白的变化同AOC3基因变化一致； 3、缺氧条件下RIMEC中VAP-1诱导的白细胞粘附功能较常氧条件下显著升高（P=0.026），2-溴乙胺能显著抑制VAP-1诱导的白细胞粘附功能，无论是在正常RIMEC中（P=0.001）还是在AOC3基因腺病毒转染后的RIMEC中（P0.001）； 4、相对于生理盐水对照组，使用20mg/kg的2-溴乙胺就能显著抑制重症失血性休克及复苏后的大鼠血清VAP-1/SSAO活性（P=0.005），并随着2-溴乙胺浓度上升而抑制程度上升； 5、相对于生理盐水对照组，使用20mg/kg的2-溴乙胺能使重症失血性休克及复苏后的大鼠血压（复苏1小时和24小时后）显著升高（P值分别0.010和0.039），能显著提高小肠真毛细血管血流速度（P=0.024），而对毛细血管前微动脉和毛细血管后微静脉的管径无显著影响（P值分别为0.184和0.237），对小肠粘膜损伤的Chiu’s评分有显著改善（P=0.022），对小肠粘膜上皮细胞的凋亡指数有显著改善（P=0.002），能提高休克大鼠24小时生存率（90%对60%）。【结论】 1、体内实验证实重症失血性休克能刺激AOC3基因及编码蛋白VAP-1的表达、酶活性显著增高，，而液体复苏能减轻这种增高； 2、体外实验证实缺氧条件能刺激AOC3基因及编码蛋白VAP-1的表达及诱导白细胞粘附功能显著增高，VAP-1/SSAO抑制剂能显著抑制这种诱导白细胞粘附功能上的增高； 3、使用VAP-1/SSAO抑制剂能显著改善重症失血性休克及复苏后的低血压以及微循环中的真毛细血管流速（而不是微血管管径），能显著改善小肠粘膜的损伤和细胞凋亡，提高大鼠24小时生存率。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R459.7

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