烧伤后一氧化氮促进表皮干细胞迁移的作用及机制研究

发布时间：2018-11-08 12:10

【摘要】：烧伤是以皮肤损伤为始发因素的创伤,损伤主要是皮肤和黏膜,严重者可伤及皮下及黏膜下组织,如骨及关节、肌肉等,甚至内脏器官等。及时封闭、修复创面是防治创面感染、减轻组织器官功能损伤、防治瘢痕增生、提高重度烧伤患者救治成功率及生活质量的基础。烧伤的根本问题就是创面修复,如何尽早封闭和修复创面是烧伤治疗中的根本。表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)是皮肤组织之中特异性干细胞,是皮肤创面愈合最重要的物质基础之一,也是皮肤及其皮肤附属器管生长发育、修复以及改建的源泉。应用表皮干细胞无限增殖能力及多向分化的潜能等,促使创面修复由功能修复到解剖修复成为了可能。因此表皮干细胞对表皮组织及其附属器官的重建具有重大价值。浅度以及深Ⅱ度烧伤创面的修复主要依赖于残存和健在的表皮干细胞脱粘附、增殖、分化以及迁移并最终修复创面,是创面愈合的主要过程,尤其是毛囊外鞘隆突部的毛囊干细胞起着重要的作用;同时表皮干细胞的脱粘附、增殖、分化、迁移等生物学行为受到体内多种因素的影响。表皮干细胞离开其特定的干细胞巢穴迁移,才具有增殖、分化能力,因而表皮干细胞离巢迁移是启动烧伤创面愈合的关键步骤。但目前关于诱使表皮干细胞脱粘附、离巢迁移、增殖、分化的因素及其机制并不清楚。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是众多的小分子生物活性介质中的一种,参与了多种生理、病理等过程。NO在创面的炎症反应、肉芽生长及创面修复中均起着重要的作用,具有参与炎症反应、扩张血管、收缩创面、抗感染以及促进创面胶原合成、成纤维细胞增殖、增强创面抗张强度、血管生成等。烧伤后早期创面即有大量NO产生,在时间上与烧伤后表皮干细胞离巢迁移修复创面现象相重叠。NO对创面愈合有多种作用机制与途径,但NO促进创伤愈合的具体作用机制尚未完全清楚,还有待进一步的深入研究。烧伤后创面产生大量NO产生,初期主要由角质细胞产生,随后主要由活化的巨噬细胞产生。创面局部产生的NO在烧伤后第三天左右达到高峰,并且几乎伴随整个创面愈合的过程。文献报道,在气道上皮细胞的体外划痕实验中NO显著促进细胞的迁移;NO可通过GC-c GMP途径使细胞骨架重排,从而促进气道上皮细胞的迁移与创面修复;NO可通过影响Rho GTP酶调节细胞骨架及细胞的粘附与迁移。因此我们推测,一氧化氮的促进创面修复作用中是通过影响角质细胞及表皮干细胞的脱粘附、增殖、分化、迁移等生物学作用实现的。no在烧伤后表皮干细胞脱粘附、离巢、迁移、分化等生物学变化中的作用及其机制未见文献报道。我们前期研究中,以硝普钠(snp)为no供体,以角质细胞株hacat细胞为研究对象,发现适宜浓度的no具有促进hacat细胞迁移作用,其作用的可能机制是:1、no通过调节细胞内cgmp的浓度升高,促进rhogtpase活化作用增强,以及蛋白表达水平增高,进而影响细胞骨架结构f-actin蛋白聚合,最终促进细胞迁移;2、no通过下调β1整合素的表达,减少细胞对细胞外基质的粘附力,进而减少细胞迁移阻力。同时我们以原代培养人表皮干细胞为研究对象,选择以snap(s-nitroso-n-acetyl-dl-penicillamine)为no供体,深入研究no对体外原代培养人esc脱粘附离巢、增殖分化及迁移功能的影响;并在体实验中通过brdu滞留标记表皮干细胞,浅二度烫伤模型研究外源性no对成年小鼠表皮干细胞离巢、迁移的作用。本课题在前期实验的基础上,我们进而探讨了烧伤患者创面中no浓度及创面中inos的表达,深入研究no促进表皮干细胞迁移的物质基础和可能机制,明确no促进烧伤等创面愈合的机理,为进一步完善一氧化氮在促进创面愈合中的基础理论和可能的临床应用打下基础。本课题重点探讨了no通过cgmp\pkg\rhogtpase途径调节表皮干细胞骨架的重排,进而促进escs迁移;以及在体no通过增强表皮干细胞迁移而促进创面再上皮化,最终修复创面。我们将本研究获得的主要结果和结论归纳如下:一、烧伤后创面no的产生:为进一步了解烧伤患者创面中no浓度及烧伤不同时间点no浓度的变化,共收集临床20例烧伤患者标本,其中水泡液46份,血清27份;深二度烧伤创面组织14份,同体正常皮肤组织14份。均符合入选标准:年龄18-55,性别不限,烧伤面积≤40%tbsa。收集水泡液、血清及组织块-80度保存。该项研究内容均告知患者,并征得患者和患者家属的同意,研究对象签署知情同意书表示愿意参加该项试验。1、水泡液及血清中no浓度检测:采用griessreagent法检测发现,小面积(烧伤面积≤40%tbsa)患者血浆中no的浓度相对恒定在6.44±0.71μm;而烧伤患者水泡液中no随伤后不同时间而有较大变化,伤后10小时内的水泡液no浓度为7.73±0.62μm,伤后10至20小时水泡液no浓度为9.45±0.65μm,伤后20至30小时水泡液no浓度为7.23±1.53μm,伤后30小时以上时水泡液no浓度为6.84±1.08μm,发现在伤后10至20小时时水泡液no浓度最高。2、烧伤创面中no浓度的测定:组织块碾磨后用同体积去离子水混合离心取上清。检测no浓度方法:采用与griessreagent同体积混合,酶标仪测量od450值,通过标准亚硝酸盐浓度标准曲线得出no浓度。结果发现:正常组织中no浓度为0.32±0.13μm,浅二度创面组织中no浓度为4.70±0.70μm。表明烧伤后创面组织中no浓度较正常组织中no浓度高出约15倍。3、深二度烧伤创面组织中inos的表达:烧伤患者正常组织及浅二度组织经石蜡包埋、切片后行免疫荧光组织化学发现,正常组织中inos表达不明显,而创面组织中在表皮的基底层及真皮组织中inos明显,其中表皮基底层inos的表达与表皮干细胞表面标志物角质蛋白ck19存在共定位。表明,烧伤后表皮干细胞中高表达inos。4、深二度烧伤创面组织及正常组织中inos蛋白的表达:烧伤患者正常组织及浅二度组织经组织蛋白性蛋白印迹检测发现,创面组织中no浓度较正常组织中no浓度高出14.8倍,表明烧伤后表皮组织高表达inos。二、原代人表皮干细胞的分离、培养及鉴定:主要是进行表皮干细胞的分离培养及细胞免疫化学、克隆实验和流式等鉴定手段,我们发现:Ⅳ型胶原10min快速黏附法可以快捷、方便的实现表皮干细胞分离富集,能较好的维持表皮干细胞的干性。1、原代人表皮干细胞的分离培养:采用Ⅳ型胶原快速粘附法结合无血清角质细胞培养基分离培养的细胞符合表皮干细胞的形态及"铺路石"样克隆生长;采用tripleselect细胞消化液消化细胞能快速消化细胞且能较好保持细胞的活性。2、细胞免疫荧光染色检测细胞中integrinβ1和ck19的表达:所培养的第二代细胞中表皮干细胞标志物keratin19和integrinβ1均呈强阳性表达。3、流式细胞仪检测分离培养细胞α6-integrin及cd71的表达:采用流式细胞分析技术发现第二代培养细胞中α6bricd71dim原代培养表皮细胞率为94.3±4.36%。4、细胞克隆形成能力检测:所培养第二代细胞具有较强的克隆形成能力,克隆形成率为33.1±4.8%。三、no对表皮干细胞迁移的影响及机制研究:(一)no对培养表皮干细胞迁移的影响:我们首先进行了no供体snap不同作用时间产生no浓度和snap对表皮干细胞的毒性检测;通过划痕实验和活性工作站完成no对表皮干细胞迁移和运动速度的检测,以及通过细胞骨架实验和pulldown技术检测no促进表皮干细胞迁移可能的物质基础。1、no供体snap产生no浓度的检测:我们通过传统no检测方法griess法测定snap加入细胞培养基后产生no情况,实验发现100μmsnap时在0、2、6、12、18、24、30、36、48小时时生成no的浓度分别为0.173、0.655、1.713、3.553、5.124、6.2818455、6.557、6.878、7.324μm;500μmsnap时在0、2、6、12、18、24、30、36、48小时时生成no的浓度分别为0.209、1.206、2.938、6.349、8.576、11.284、12.448、13.601、14.532μm。表明0-500μmsnap在细胞培养基中生成no浓度与snap浓度成正相关、与持续时间呈正相关。2、snap对表皮干细胞安全有效作用浓度测定:采用cck-8检测相对活细胞数量,结果snap浓度在0-500μm内通过cck-8测量的escs细胞数无显著差异(p0.05),而snap浓度在1000-4000μm时活细胞数量较对照组显著减少,snap1000μm时活细胞数较对照组比较细胞存活率为52.12±5.96%;snap2000μm时活细胞数较对照组比较细胞存活率为6.79±1.16%;snap4000μm时活细胞数较对照组比较细胞存活率为5.62±1.63%。表明no供体snap的有效安全作用浓度为0-500μm。3、划痕实验检测no对escs迁移功能的影响:结果发现,随着snap浓度的升高(0~100μmol/l),划痕后不同时间点细胞迁移率较对照组均增加;其中划痕后12、24h,10、100μmol/lsnap组的迁移率较对照组有显著差异(p值均小于0.01);而300、500μmol/lsnap组的迁移率较对照组减少,其中在划痕后18、24小时时有显著差异(p值均小于0.05)。其中划痕12小时时与对照组迁移率(48.8±2.7%)相比,100μmol/lsnap组迁移率达到了82.1±15.8%(p0.01),而500μmol/lsnap抑制的细胞迁移率为8.2±7.2%。实验表明低浓度的no供体snap(0-100μmol/l)时对细胞具有促进迁移的作用。4、活细胞工作站检测no对escs运动速度的影响:为进一步检测no对表皮干细胞运动功能的影响,我们通过活性工作站从细胞运动速度方面测定no对表皮干细胞运动速度的影响。研究发现,snap浓度在0~100μmol/l时细胞运动速度逐步提高,100μmol/lsnap组的细胞运动速度为1.07±0.18μm/min,与其他组比较细胞运动速度最快。表明,低浓度的no供体snap(0-100μmol/l)时对细胞具有促进细胞运动的作用,而当snap高浓度时对细胞运动的抑制作用显著。5、激光共聚焦检测no对escs细胞骨架蛋白f-actin聚合作用:细胞骨架是细胞迁移与运动的基础,其中细胞骨架蛋白中最重要的是f-actin蛋白,f-actin蛋白的重组与细胞迁移具有直接关系。我们通过鬼笔环肽染色、激光共聚焦研究发现,结果发现:100μmno供体snap组huescs应力纤维f-actin纤毛明显增多,胞内应力性纤维束增粗,而阴性对照组纤毛稀少,胞内应力性纤维束纤细;经细胞骨架f-actin荧光染色强弱分析得出实验组较对照组应力性纤维增加了31.7%,具有显著性差异p=0.001。实验表明,no促进huescs应力纤维f-actin的聚合。6、pull-down技术检测no活化rhogtpase的作用:rhogtp酶是真核细胞中重要的信号转导分子,通过肌动蛋白和肌球蛋白对细胞骨架进行调控进而调控细胞运动,对肌动蛋白细胞骨架的调节起着主要作用。为此,我们通过pulldown技术检测发现,rhoa活化作用中snap组是对照组的4.14±0.33倍;rac1活化作用中snap组是对照组的1.78±0.07倍;cdc42活化作用中snap组是对照组的1.22±0.17倍。实验表明,100μmno供体snap组对rhoa、rac1具有显著的活化作用,而对cdc42的活化作用不明显。(二)no对培养表皮干细胞迁移的机制研究:cgmp-pkg是no最重要的下游信号转导途径,为此我们通过细胞划痕实验、细胞运动速度实验、细胞骨架实验、pull-down实验,分别分组给予cgmp抑制剂odq、pkg抑制剂rp-8pcpt-cgmps、rhoa抑制剂rhosin、cdc42抑制剂zcl278、rac1抑制剂z62954982及snap处理,此外还采用rhoa、rac1、cdc42的特异性小干扰rna验证“no通过cgmp-pkg调节活化rhogtpase,进而影响细胞骨架蛋白f-actin的聚合,最终促进escs迁移”的假说。1、划痕实验检测cgmp\pkg\rhogtpase信号通路在no促进escs迁移中的作用:结果发现,对照组的细胞迁移率为74.25±5.59%;snap组的细胞迁移率为94.06±5.59%;odq+snap组的细胞迁移率为75.17±7.02%;rp-8pcpt-cgmps+snap组的细胞迁移率为70.91±10.09%;rhosin+snap组的细胞迁移率为71.39±9.74%;z62954982+snap组的细胞迁移率为76.28±7.26%;zcl278+snap组的细胞迁移率为86.58±4.89%;snap和cgmp、pkg的激动剂显著促进escs细胞的迁移,迁移率与对照组相比分别增加了9.78%和11.12%。结果表明,snap对escs细胞的迁移作用可被cgmp、pkg、rhoa、rac1抑制剂阻断,其中rhoa抑制剂的抑制作用最显著,而cdc42抑制剂的阻断作用不明显。2、活细胞工作站实验检测cgmp\pkg\rhogtpase信号通路在no促进escs运动速度的作用:结果发现,对照组的细胞运动速度为0.72±0.08μm/min;snap组的细胞运动速度为0.93±0.14μm/min;odq+snap组的细胞运动速度为0.78±0.06μm/min;rp-8pcpt-cgmps+snap组的细胞运动速度为0.74±0.07μm/min;rhosin+snap组的细胞运动速度为0.73±0.07μm/min;z62954982+snap组的细胞运动速度为0.72±0.06μm/min;zcl278+snap组的细胞运动速度为0.73±0.07μm/min。表明:no供体snap促进escs细胞的运动,其作用可被cgmp、pkg、rhoa、rac1抑制剂阻断,其中rhoa抑制剂的抑制作用显著,而cdc42抑制剂阻断snap对escs运动速度的影响弱。3、激光共聚焦检测cgmp\pkg\rhogtpase信号通路在no对escs细胞骨架蛋白f-actin聚合中的作用:我们采用imagej分析了皮层肌动蛋白(corticalactin)和丝状伪足(filopodia)观察细胞骨架蛋白f-actin的聚合情况。经统计分析发现皮层肌动蛋白对照组为103.33±3.41%,snap组为190.26±2.92%,odq+snap组为87.41±3.20%,rp-8pcpt-cgmps+snap组为104.33±1.75%,rhosin+snap组为80.12±2.21%;z62954982+snap组为120.83±3.61%,zcl278+snap组为141.68±4.75%。细胞的丝状伪足百分率对照组为25.00±3.86%,snap组为41.82±7.60%,odq+snap组为19.66±3.87%,rp-8pcpt-cgmps+snap组为25.27±7.57%,rhosin+snap组为24.00±6.29%,z62954982+snap组为31.87±3.49%,zcl278+snap组为31.14±11.69%。结果表明:得出no供体snap对esc细胞骨架蛋白f-actin具有聚合作用;cgmp\pkg以及rhogtpase的rhoa,rac1抑制剂均可阻断snap对escf-actin的聚合作用,而cdc42抑制剂的阻断作用不显著。4、pull-down技术检测cgmp\pkg在no活化rhogtpase中的作用:采用pull-down技术检测no供体snap处理表皮干细胞24小时对rhoa,cdc42和racl的活化。结果发现,对rhoa活化作用以对照组设为1,snap组为4.46±0.14;odq+snap组为0.89±0.11;rp-8pcpt-cgmps+snap组为1.52±0.12;对racl活化作用snap组为2.08±0.08,odq+snap组为0.72±0.12,rp-8pcpt-cgmps+snap组为1.22±0.17;对cdc42活化作用snap组为1.16±0.24,odq+snap组为1.21±0.13;rp-8pcpt-cgmps+snap组为0.89±0.13。表明no通过cgmp、pkg调节rhoa,rac1的活化作用。5、pull-down技术检测不同时间snap对活化rhoa的作用:采用pulldown技术检测snap在处理后6、12、18、24小时对rhoa,cdc42和racl的活化作用。结果发现,灰度值比较中对照组活化蛋白比总蛋白设为1(0小时),6、12、18、24小时snap组对rhoa活化作用分别为3.38±0.56、4.09±0.46、3.60±0.39、4.17±0.43倍;而snap组对racl活化作用分别为2.55±0.48、2.69±0.75、2.56±0.47、2.69±0.44。表明在给予snap处理后escs中活化的rhogtpase持续高表达。6、sirna转染体外培养人表皮干细胞及sirna干扰效率检测:50nm的sirna采用脂质体2000转染表皮干细胞,以与rhogtpase无同源性的葡萄糖氧化酶glo的sirna作为阴性对照,为避免脱靶效应每一个mrna均采用两个不同的sirna。采用wb检测sirna的干扰效率均大于75%。同时我们采用rhoa、rac1和cdc42的特异性sirna干扰实验进一步验证了no通过rhogtpase的rhoa和rac1在no促进表皮干细胞迁移中的作用。7、sirna干扰后检测rhogtpase在no促进escs迁移中的作用:采用rhogtpase的特异性sirna干扰目的基因的表达后进行划痕实验,结果发现,snap组的细胞迁移率为92.89±3.99%;siglo+snap组的细胞迁移率为90.68±4.22%;rhoasirna+snap组的细胞迁移率为53.25±5.78%、51.42±5.23%;rac1sirna+snap组的细胞迁移率为55.23±9.92%、61.06±8.43%;cdc42sirna+snap组的细胞迁移率为81.62±10.75%、80.29±13.04%。表明rhoasirna、rac1sirna可阻断snap对esc的迁移作用。表明,no通过rhogtpase的rhoa和rac1影响表皮干细胞的迁移作用。8、sirna干扰后检测rhogtpase在no促进escs运动中的作用:采用rhogtpase的特异性sirna干扰目的基因的表达后进行活性工作检测细胞的运动速度实验,结果发现,siglo+snap组的细胞运动速度为0.96±0.07μm/min;rhoasirna+snap组的细胞运动速度为0.74±0.06μm/min、0.76±0.07μm/min;rac1sirna+snap组的细胞运动速度为0.83±0.05μm/min、0.83±0.03μm/min;cdc42sirna+snap组的细胞运动速度为0.90±0.10μm/min、0.93±0.09μm/min。表明rhoasirna、rac1sirna可阻断no对esc运动速度的促进作用。9、sirna干扰后检测rhogtpase在no促进骨架蛋白f-actin聚合中的作用:采用rhogtpase的特异性sirna干扰目的基因的表达后给予no供体snap处理24小时。通过imagej分析了皮层肌动蛋白(corticalactin)和丝状伪足(filopodia)的表达观察细胞骨架蛋白f-actin的聚合与重排作用。研究表明,rhogtpase的rhoa、rac1的mrna干扰小rna可阻断snap对escs的f-actin的聚合作用。四、no对皮肤创面愈合及在体表皮干细胞迁移的影响:为进一步探讨no在创面愈合、上皮化以及进一步验证no对esc的在体迁移情况,我们在brdu在体标记表皮干细胞基础上采用全层皮肤缺损模型研究no在创面愈合、上皮化以及对esc迁移。应用brdu在体标记表皮干细胞后孔器器打孔,伤口大小为直径4.5mm,分组分别给予腹腔注射生理盐水组,甘氨酸(gly),一氧化氮合成底物(l-精氨酸)及一氧化氮合酶抑制剂(l-nmma)。分别于伤后0、1、3、5、7、9天观察创面愈合情况,于第9天取材做he染色观察创面上皮化情况,于第12天观察esc迁移情况。1、no在创面愈合中的作用:我们采用全层皮肤缺损模型模型检测no对创面的愈合作用。结果发现,致创后第1、3、5、7、9天创面愈合率分析生理盐水组分别为20.08±3.03%,47.97±4.99%,70.00±3.49%,80.54±2.17%,70.95±3.56%;L-精氨酸组致分别为29.30±3.55%,47.97±4.99%,89.61±2.69%,94.74±2.43%,98.75±0.81%;L-NMMA组为18.91±3.06%,44.47±4.99%,64.58±4.52%,72.45±2.52%,76.72±3.84%。结果表明,创面缺损模型中NO合成底物L-精氨酸促进创面愈合;NO合成酶抑制剂L-NMMA创面愈合速度较对照组明显减慢。2、NO在创面上皮化中的作用:同上我们在致创后第9天创面组织取材,切片行HE-染色并经统计分析结果。发现,生理盐水组未上皮化创面大小为1.44±0.32mm,未上皮化创面大小甘氨酸组为1.37±0.52mm、L-精氨酸组0.38±0.41mm、L-NMMA为2.54±0.61mm。实验表明,创面缺损模型中NO合成底物L-精氨酸促进创面上皮化,具有显著性差异;NO合成酶抑制剂L-NMMA与对照组比较明显抑制创面上皮化。3、BrdU标记ESC后全层皮肤缺损模型中NO对ESC迁移作用研究:Brd U在体标记表皮干细胞基础上,在全层皮肤缺损模型中给与NO处理,研究NO对ESC迁移情况。研究发现,在同一高倍视野再生表皮中BrdU阳性细胞对照组为12.27±2.67个,甘氨酸组为14.88±5.14个,L-精氨酸组为24.04±8.34个,L-NMMA组为6.67±2.42个。表明,L-精氨酸组创面上皮化中的BrdU阳性细胞较其他组显著增多,同时NO合成酶抑制剂L-NMMA组中BrdU阳性细胞较其他组少。总结:1、烧伤后表皮干细胞可能通过高表达i NOS,而促进烧伤创面NO的大量产生;2、Ⅳ型胶原快速黏附结合K-SFM角质细胞专用无血清培养基培养是一种简单、快捷、有效分离、纯化人表皮干细胞的方法;3、NO供体SNAP对体外培养人表皮干细胞的最佳作用浓度为100μM。4、NO通过cGMP/PKG调节Rho GTPase的Rho A和Rac1的活化影响细胞骨架蛋白F-actin的聚合,进而促使表皮干细胞迁移,最终促进创面愈合。5、在体实验中,NO可能通过促进表皮干细胞迁移,而促进创面再上皮化,最终促进皮肤创面愈合。综上所述,烧伤后创面表皮干细胞可能通过高表达i NOS,产生大量NO,产生的NO通过c GMP/PKG调节Rho GTPase中Rho A和Rac1的活化,继而增加细胞骨架F-actin蛋白的聚合,进而促使表皮干细胞迁移,最终促进创面愈合。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R644

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