循环microRNAs 208a,208b在急性ST段抬高心肌梗死诊断中的价值

发布时间：2019-03-27 14:33

【摘要】：研究背景:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)已经成为使全球范围内的致死和致残率上升的主要原因之一。急性心肌梗死(AMI)是指冠状动脉急性闭塞,出现持久而严重的心肌缺血所致的局部心肌急性坏死。早期诊断AMI,准确地评价其病情严重度和判断预后,及时有效的干预治疗,是治疗AMI的关键。据世卫组织统计数据显示,全球每年约有一千七百万人死于心脏病发作和中风,约有300～400百万人患AMI;在欧洲则每6个男性和每7个女性死者中即有1人死于AMI;而在美国每25秒就会发生1次冠脉事件,每1分钟就有1人死于冠心病[5]。每年有将近超过3百万人死于冠状动脉疾病(CAD)。目前,中国大约有2百万人患有急性心肌梗死疾病(AMI)。而快速、正确的诊断对于立即采取措施并强化治疗,进而降低死亡率有重要的作用。若在1小时内(黄金时间)有效完成急性心肌梗死(AMI)治疗,死亡率可以降低3%-9%。若治疗时间延迟3-4小时,死亡率则将会高出5倍。12导联心电图(ECG)和心肌肌钙蛋白(cTn)是诊断急性心肌梗死(AMI)的基石。但心电图本身不足以诊断心肌缺血或坏死,因为ST段改变也可见于其他情况,例如急性心包炎、左心室肥大、左束支传导阻滞、Brugada综合症、应激性心肌病、早期复极综合症等疾病。目前,据美国心脏病学会(ACC)和欧洲心脏病学会(ESC)定制的治疗指南中指出,急性心肌梗死(AMI)诊断主要基于受损心肌细胞的心肌肌钙蛋白T和I(cTnT和cTnI)或肌酸激酶同工酶(CK-MB)等生物标志物的升高而确定。目前使用的cTnI是从心肌细胞结构蛋白缓慢持续的释放,在急性心肌梗死(AMI)发作后3～6h才会开始升高,可能会造成诊断延误。新开发的高敏感性cTnT检测(hs-cTnT)检测方法则可以在发病3h内早期诊断出AMI,使得在心肌缺血早期就能表现cTnT阳性,连续检测hs-cTn(间隔3-6小时)更有助于提高AMI诊断准确率,可为早期心肌缺血诊断提供依据。然而,患有缺血所致的急性心肌损伤、慢性稳定性冠心病、心力衰竭、心脏结构性病变、慢性肾脏病等患者,以及明显健康的人群中也会出现hs-cTn升高的情况。但尽管如此,指导方针建议连续检测hs-cTn(间隔3-6小时)更有助于了解肌钙蛋白释放的动态变化过程,从而帮助鉴定患者是否急性心肌梗死。hS-cTnT检测的主要缺点是急性心肌损伤(缺血所致)或慢性损伤(心脏结构性病变和慢性肾脏病等其他病变所致)也会引起cTn升高,从而导致hs-cTnT检测得出假阳性结果。CK-MB作为AMI诊断标志物的缺点在于,与cTn相比它具有较低的特异性,且症状发作较长一段时间后(7h)才会上调。因此,仍需寻找准确、快速地诊断急性心肌梗死的理想早期标志物。最新研究表明,循环微小RNA(microRNA,miRNAs,miRs)可以辅助多种系统疾病的早期诊断。miRs是一类具有非编码功能、高度保守的内源性小RNA,可通过完全互补或不完全互补的方式识别并结合靶基因miRNA的3' UTR,从而降解靶基因miRNA或抑制其翻译表达,实现对靶基因表达水平的转录调控,调节细胞增殖、分化与凋亡,与个体发育、机体代谢,以及多种疾病的发生、发展密切相关,在较长时间内能够以某种机制稳定存在于人类及动物的血液、唾液、尿液等体液中。可能作为生物标志物用于肿瘤、代谢性疾病、组织损伤、炎症疾病等多种疾病临床诊断。MiRNAs首次于1993年被LEE等专家在研究秀丽隐杆线虫发育时发现,是一类广泛存在于真核生物中的平均长度约为22个核苷酸(nt)的内源性非编码调控单链小分子RNA。Lawrie等研究弥漫性大B细胞淋巴瘤时,使用实时荧光定量PCR检测患者血清中miRs,首次发现其在血清中表达,从此揭开血清miRs的研究序幕。血液中核糖核酸酶的存在,使得人们对血液中miRs是否能稳定存在表示怀疑,然而Chen等发现循环中miRs经反复融冻、强酸强碱及脱氧核糖核酸酶处理后,其完整性无显著性差异。据估计,目前在人体内发现的miRNAs达1900多种,有些miRNA在人体中广泛分布,而有一些只在特定的细胞和组织内表达,但对于循环中多数miRs来讲,其分布具有组织及细胞特异性,血中miRs的表达在心肌肥大、癌症、心衰患者中变化很大,因此被作为疾病诊断及预后的指标来研究。在心脏内检测出的miRNA则已超过200多种,其中大约有121多种miRNAs在AMI患者血液中与健康对照组相比有显著变化。20多种心脏特异性和非特异性miRNA被认为是可能潜在的AMI诊断标志物。miRNAs表达具有细胞组织特异性及血浆(清)中存在的稳定性,是一种极具潜力的急性心肌梗死(AMI)诊断标志物。某些miRNA,通常富集于心肌和骨骼肌(miR-1,-133a和-499-5p)或心肌细胞特异性(miR-208a和208b),并心肌梗死后释放入血液循环。以往的研究通常以人类和啮齿类动物作为研究对象,主要研究AMI患者和动物miR-1,miR-133a,miR-133b和miR-499等循环miRNAs的表达水平升高的现象。但这些miRNA不仅仅在心肌细胞中表达,而且在骨骼肌中也可检测到。因此,骨骼肌的损伤也可导致上述miRNAs表达水平上调。所有已知的miRNA中,mir-208a是最重要的、在心脏健康以及疾病的发生、发展过程中起关键作用的,仅心肌所特有的心脏富集miRNA之一,当其他器官损伤时,其表达水平无变化。miR-208家族包括两个成员:miR-208a和miR-208b,该两种miRNA的编码基因位于肌球蛋白重链基因,并且均在心脏中高表达,其中miR-208b在骨骼肌中也呈高表达。miR-208a最初命名为miR-208,由Lagos-Quintana及其同事在研究人和老鼠的心肌组织中发现,由a-MHC基因的内含子29(Myh6)编码而成。miR-208b是由心肌β-MHC基因的内含子31(Myh7)编码,特异性表达于心肌组织,与心肌纤维、心肌肥厚、心力衰竭及心肌缺血发生有关。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNAs也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。miR-208a和miR-208b的种子区域有相同核苷酸序列,其余核苷酸序列中只有三个核苷酸是不相同的。因此,这两个miRNA所调控的基因可能相同。研究目的:本研究的主要目的在于探讨心肌特异性miR-208a、miR-208b作为急性心ST段抬高型肌梗死(acute STEMI)诊断指标的能力,并与cTnI水平进行比较。分析miR-208a/b与心脏型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、脂质以及左心室射血分数之间的相关性。因此将研究分成6个部分:1.采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测急性ST段抬高心肌梗死后心肌血浆miRNAs(mir208a和mir208b)的水平。2.评估循环miR-208a/b早期诊断AMI的可行性。3.评估miR-208a和miR-208b的诊断价值,并与当前的金标准cTnI和CK-MB进行比较。4.采用ELISA法检测急性STEMI患者血浆h-FABP和hs-CRP水平,并探讨它们与心肌特异性miRNAs(mir208a和mir208b)的相关性。5.评估miR-208a/b与血脂的相关性。6.通过二维超声心动图检测左室射血分数,并评估其与心肌特异性miRNAs(mir208a和mir208b)的相关性。患者与方法:分别对列入选自2012年12月至2013年10月,症状发作后12h内入住天津医科大学第二医院CCU病房的39例急性ST段抬高心肌梗死(STEMI)患者,25例不稳定心绞痛(UAP)患者,以及29例参加健康预防保健项目的心电图正常、临床确诊无心血管疾病的健康人。本研究经天津医科大学第二医院医学伦理委员会批准,取得了所有患者知情同意。急性STEMI患者的诊断参照最新版"心肌梗死全球统一定义"的诊断标准:血清心肌标志物(主要是肌钙蛋白)升高(至少超过99%参考值上限),并至少伴有以下一项临床指标:(1)缺血症状;(2)新发生的缺血性ECG改变(新发生的ST-T改变或左束支传导阻滞);(3)ECG病理性Q波形成;(4)影像学证据显示有新的心肌活性丧失或新发的局部室壁运动异常;(5)冠脉造影证实冠状动脉内有血栓。UAP的诊断在明确的冠心病诊断的基础上,并有以下病史特征:(1)稳定性心绞痛加重(症状更重、持续时间更长或更频繁);(2)新出现的心绞痛,通常在1个月内,较轻劳力活动即可诱发心绞痛;(3)在静息或进行轻度劳力活动时自发出现心绞痛,且不伴有肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK-MB)和cTnI等血清标志物的升高。入选患者中排除了标准急性创伤和因严重肾功能损伤而需做肾透析的患者,以及入院时症状发作大于12个小时的患者。取血时间为AMI发病后12h内(3.5±2.93)。抽取2.5ml外周静脉血于ETDA管中,2h内在4℃条件下2000g离心15 min,分离血浆转移至新的无RNA酶的试管中,并存储于-80℃直至RNA分离。第一份血液样本采集于患者刚入住冠心病监护病房(CCU)时,另一份则采集于次日早上6点(发病后16.46±4.98 h)。另外,于招收时,抽取29例健康人的血浆样本一次作为健康对照组,且正常健康人静脉血均来自清晨空腹。对所有参与本研究项目的患者血标本的miR-208a、miR-208b表达水平进行测定,并与标准生物标志物cTnI进行比较。从400 u L血浆样本,提取miRNA,使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(康为世纪,中国),将提取的miRNA反转录成单链cDNA。利用SYBR实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCRs)检测血浆中miR-208a和miR-208b的表达量。目前,还没有统一的使用于qRT-PCR的特定内参。所有qRT-PCR采用相对定量进行分析,以hsnRNA U6(HmiRQP9001,GeneCopoeia)作为内参进行校正和标准化。采用2-△△Ct法分析相对表达量。根据制造商的说明,采用ELISA法测定血浆心肌肌钙蛋白I(cTnI),CK-MB,hs-CRP和h-FABP。左室射血分数(LVEF)则采用2D二维超声心动图测量。Student t检验和Mann-WhitneyU检验分别用来对比两组分类变量和连变量间的差异,多组间比较采用one way ANOVA或Kruskal-Wallis检验。Spearman等级相关分析用来描述两个变量的相关性。ROC曲线及曲线下面积(AUC)用来评价血清miR-208a和miR-208b诊断的意义:P《0.05认为具有统计学意义。结果:急性STEMI患者血浆中miR-208a、miR-208b表达水平显著高于健康对照组,分别为健康对照组的15.18倍(P0.001)和9.51倍(P0.001)。急性STEMI患者与健康对照组的miR-208a和miR-208b的ROC曲线有明显差异,曲线下面积(AUC)分别为0.955(95%可信区间0.912-0.999),P=0.000和0.894(95%可信区间 0.813-0.974),P=0.000。这些心脏富集 miR-208a、miR-208b 的表达水平在UAP血浆中与健康对照组相比均略有上升,分别是健康对照组的5.39倍(P=0.000)和2.31倍(P =0.0009)。UAP患者与健康对照组的miR-208a和miR-208b的ROC曲线有明显差异,曲线下面积(AUC)分别为0.825,(95%CI 0.702-0.948),P=0.000 和 0.705,(95%CI 0.546-0.863),P=0.015。急性 STEMI与UAP组的miR-208b表达水平之间有明显的统计学差异(P=0.047)。cTnI具有良好的准确性,以区分急性STEMI与UAP患者(曲线下面积AUC 0.848,(95%CI 0.743-0.954),P=0.000。miR-208a 与 miR-208b 的曲线下面积分别为 0.659,(95%CI 0.502-0.817),P=0.040 和 0.695,(95%CI 0.542-0.848),P=0.012。急性STEMI发作后,上调的循环miR-208a和miR-208b水平在16.46±4.98小时后基本恢复到健康对照组水平(P0.05)。胸痛发作后,3个小时内入院的急性STEMI患者中,26/26(100%)的患者的miR-208a有上升,23/26(88.46%)的患者的miR-208b有上升,而仅有14/26(53.85%)的患者的cTnI呈阳性。此外,循环miR-208a的表达与cTnI呈正相关(P=0.027)。4/29(13.79%)的健康对照组的miR-208a呈假阳性,3/29(10.34%)的健康对照组的miR-208b呈假阳性,这表明,miR-208a与miR-208b的特异性分别为86.21%和89.66%。入院时,症状发作已超过3个小时以上的急性STEMI患者血浆中miR-208a、miR-208b以及cTnI表达水平均有升高。以上数据显示,这些miRNAs对诊断AMI具有敏感性和特异性,提示miR-208a和miR-208b可以作为早期诊断AMI的生物标志物。急性STEMI患者的h-FABP表达水平明显高于健康对照组P=0.002,与UAP患者相比P=0.600。h-FABP具有中等相关性,以区分AMI患者与健康对照组,曲线下面积 AUC 0.749(95%CI 0.614-0.883),P=0.002。h-FABP 与miR-208a 和 miR-208b 呈中等相关性(分别为 rho=0.289,P=0.009 和rho=0.320,P=0.003)。急性STEMI患者的血浆hs-CRP表达水平高于健康对照组(P=0.000)和UAP组(P=0,033)。UAP组的hs-CRP水平高于健康对照组,P=0.000。Hs-CRP可以很好的区分AMI患者与健康对照组,曲线下面积AUC of 0.951(95%CI 0.895-1.007),P=0.000。我们发现,miR-208a 和 miR-208b 的表达与 hs-CRP呈中等正相关性(分别为 Spearman rho=0.287,P=0.013 和 rho=0.346,P=0.002)。另外,根据研究显示,急性STEMI患者血浆miR-208a、miR-208b分别与HDL呈负中等相关关系,分别为 Spearman rho=-0.256.P=0.033 和 rho=-0.244,P=0.040.这两个miRNAs与血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和超低密度脂蛋白(VLDL)并无相关关系。并且,急性STEMI患者血浆miR-208a、miR-208b分别与左心室射血分数(LVEF)呈高度负相关关系,分别为rho=-0.602(P = 0.000)和 rho=-0.556(P = 0.000)。结论:1、miR-208a、miR-208b表达水平在急性STEMI患者血浆中显著高于健康对照组。2、循环心脏特异性miR-208a和miR-208b可能是潜在的早期、快速、准确诊断AMI的生物标志物。3、血浆miR-208a和miR-208b的表达水平与炎症标志物hs-CRP和坏死标志物h-FABP有相关性。另外,还与LVEF和HDL存在相关性。4、循环心脏特异性miR-208a和miR-208b可能是AMI的预测标志物。5、这些miRNA可能从活体心肌细胞释放入血液循环,对心肌起保护作用。6、需要由规模大、设计合理的规范化研究对循环miRNAs作为潜在的诊断和预后的急性心肌梗死生物标志物进行证明。7、此外,需要了解miRNAs从心肌哪个部分,或者在什么条件下会释放入血液循环。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R542.22

【相似文献】