低氧通过CD9调控创面修复主要效应细胞移行与增殖的研究

发布时间：2019-07-16 15:14

【摘要】：创面愈合是十分复杂的过程，其中最为重要的是角质细胞的迁移和成纤维细胞的移行，在愈合的过程中，角质细胞通过松脱细胞与细胞，细胞与基质之间的桥粒与半桥粒的连接，还有改变细胞运动蛋白等来配合细胞向创面中心移行。而这过程受生长因子，细胞因子，趋化因子，抗菌肽，氧分压以及金属蛋白酶基质等诸多因素的影响。大量实验证明创面形成后，因为创面局部耗氧量增加以及血管网遭破坏，而导致创面局部形成低氧环境。创面低氧也成为创面形成后普遍存在的现象，因此聚焦了大量低氧环境对创面愈合的研究。低氧在创面愈合中不仅仅影响细胞代谢，低氧环境还可以调控生长因子的生成，促进成纤维细胞的增殖以及加快表皮细胞的移行。但是其具体分子机制不是十分明确。 MMPs是一组能够水解细胞外基质的蛋白裂解酶，MMP-9是其家族中的重要一员，又称Ⅳ型胶原酶或明胶酶。MMP-9合成后以酶原的形式从胞内分泌到胞外。MMP-9参与了急性创面修复的一些早期步骤,包括角质形成细胞从基底膜脱离,促进细胞沿创面基质爬行等。MMP-9表达升高可促进上皮细胞的移行；反之，则抑制表皮细胞移行。低氧环境可以促进MMP-9的表达，而其中低氧因素对表皮细胞表达MMP-9有促进作用，而对成纤维细胞无明显作用。 CD9是一种24kDa的细胞表面四次跨膜蛋白，该蛋白在血小板活化与凝聚，精卵融合，细胞移行和增殖等多方面均发挥作用。其中机制目前不完全清楚，我组前期实验发现创面形成后角质形成细胞CD9表达下降，可能与细胞移行有关。通过研究发现体外实验中，单纯低氧因素可以降低表皮细胞CD9的表达，却使得成纤维细胞CD9表达升高。以往有研究发现在卵细胞中CD9可通过整合素β1提高细胞运动性。但是，目前仍然没有基础研究创面中低氧如何通过调节CD9参与创面愈合的过程。 在本研究中，我们发现在低氧条件下，HaCaT细胞CD9表达下调，但是低氧未明显促进细胞移行，而在成纤维细胞中CD9表达升高，，可促进其增殖，并在创面愈合过程中具有积极作用。 1.材料与方法 采用体外实验的方法。 比较常氧及低氧条件下表皮细胞及成纤维细胞移行及增殖的变化，遵循既有方法，原代培养人成纤维细胞，应用表皮细胞系HaCaT细胞株。给予两种细胞2%氧气培养环境，应用transwell及细胞划痕观察细胞移行，CCK-8及Brdu标记法测定细胞增殖，于2%氧气下培育24h后观察两种细胞的移行既增殖变化。以观察低氧环境其对创面修复主要细胞的生物学效应。 给予表皮细胞及成纤维细胞2%氧气(93%N2，5%CO2,2%O2)作用12h，18h和24h后，检测缺氧条件下，以Western blot实验检测CD9，MMP-9，p-AKT和p38蛋白表达量，同时应用明胶酶谱测两种细胞在低氧环境下胞外分泌MMP-9的。应用real time PCR检测低氧下HaCaT细胞MMP-9mRNA的表达。 2.主要结果与结论 2.1应用Western blot检测MMP-9蛋白表达，发现低氧3h组与低氧6h组中HaCaT细胞MMP-9蛋白表达水平比常氧对照组显著增加。而在成纤维细胞中，无论是常氧或是低氧培养条件，几乎未检测到MMP-9表达。 2.2而在明胶酶谱法检测MMP-9的胞外分泌也发现HaCaT表皮细胞低氧6h组比常氧对照组显著差异(P=0.001)。而成纤维细胞无论常氧还是在低氧培养下，其培养液中胞外分泌的MP-9的含量都极少。 2.3应用Real time PCR检测MMP-9mRNA表达发现低氧培养HaCaT细胞6h后，HaCaT细胞MMP-9mRNA水平较常氧对照组明显增高。提示低氧环境从翻译水平上调控表皮细胞MMP-9的表达。 2.4应用2%氧含量模拟创面缺氧环境，对成纤维细胞进行低氧培养，应用CCK-8及Brdu增殖细胞免疫染色检测细胞增殖情况。实验结果显示低氧组(H)较常氧对照组(Con)增殖快(P0.05)。 2.5我们在低氧环境下培养表皮细胞及成纤维细胞，分12h、18h及24h观察CD9蛋白表达情况。实验结果显示成纤维细胞缺氧组(H)较常氧对照组(Con)CD9蛋白表达明显增高(P0.05)。而表皮细胞缺氧组(H)较常氧对照组(Con)CD9蛋白表达明显降低(P0.05)。 2.6我们应用高表达CD9腺病毒瞬时转染成纤维细胞72h后，应用western blot检测细胞CD9的表达，发现55kd(即CD9与GFP融合蛋白)处高表达转染组较空载组表达增加，而25kd处无明显变化，说明瞬时转染成功。同时应用CCK8的方法检测成纤维细胞的增殖，实验结果显示CD9高表达组较空载对照组明显升高(P0.05)，提示CD9高表达可促进成纤维细胞增殖。 2.7通过对转染成纤维细胞中p-Akt及p38进行western blot检测，发现CD9高表达后p-Akt及p38较正常对照组(Con)以及空载对照组明显升高(P0.05)，提示AKT或者p38途径可能参与CD9高表达后细胞增殖过程，但是具体机制有待进一步证明与深入研究。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R641

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本文编号：2515138