负压封闭引流减轻肢体骨骼肌缺血再灌注损伤及其相关肺损伤机制的研究

发布时间：2019-07-30 10:44

【摘要】：缺血再灌注(Ischemia Reperfusion, I/R)指器官或组织在血供中断或受限后重新恢复血供的病理过程。缺血的组织／器官在血供恢复、缺氧解除后,表现出较缺血阶段更剧烈的炎症反应和组织／器官损伤,称为缺血再灌注损伤(Ischemia and Reperfusion Injury,IRI)。骨骼肌缺血再灌注损伤见于创伤、外科手术及其它疾病,肢体／躯干部位挤压伤可以导致严重的骨骼肌缺血再灌注损伤,甚至还会引发全身炎症反应综合征、急性肺损伤甚至多器官功能衰竭。负压封闭引流(Vacuum Sealing Drainage, VSD)广泛应用于创伤等各外科领域,可以减轻局部创伤组织水肿和炎症反应,增加组织血流灌注,并可降低全身炎症反应综合征和多器官衰竭的发生率。本研究论文拟通过临床观察,分析合并血管损伤的下肢开放性骨折病人使用VSD治疗的效果及安全性：并通过试验研究探讨VSD减轻骨骼肌缺血再灌注损伤及其相关肺损伤的作用机制。1.临床研究目的临床研究部分主要观察负压封闭引流治疗下肢挤压伴开放性骨折合并血管损伤病人的安全性和临床疗效。方法搜集我院创伤外科2014年1月至2015年12月所有合并血管损伤的严重下肢开放性骨折病人的病例资料,按照急诊术后是否以VSD覆盖创口分为VSD治疗组及非VSD治疗组,比较两组病人急诊术前肢体缺血时间、截肢评分、急诊术后血管痉挛、栓塞、出血等并发症例数,再次血管探查,创口感染,急性肺损伤,截肢例数,创口闭合时间和植皮／皮瓣例数,以及血清CRP、IL-6和肌红蛋白浓度,分析负压封闭引流对该类病人的治疗效果。结果两组病人急诊术前的缺血时间,截肢评分,血清CRP,IL-6和肌红蛋白以及术后血管痉挛、栓塞、出血等并发症发生率比较无差异；VSD治疗组急诊术后再次血管探查手术率,创口感染率,急性肺损伤发生率均低于非VSD治疗组：VSD治疗组伤后创口闭合时间也少于非VSD治疗组且差异具有统计学意义(P0.05)；在治疗72小时后,VSD组患者血清CRP,IL-6以及肌红蛋白水平均低于非VSD治疗组,且差异具有统计学显著性(P0.05)。结论负压封闭引流治疗并发血管损伤的下肢开放性骨折创口,并不增加吻合血管痉挛、栓塞及出血的发生率,且可以减少创口闭合时间,促进创口愈合,减轻全身炎症反应,但负压封闭引流是否能减轻骨骼肌缺血再灌注损伤,还有待进一步试验研究的验证。2.实验研究目的研究负压封闭引流减轻肢体骨骼肌缺血再灌注损伤及其相关肺损伤的机制。方法试验研究部分选用雄性Sprague Dawley大鼠建立后肢骨骼肌缺血再灌注损伤动物模型,通过夹闭和开放股动脉实现大鼠左后肢缺血4小时、再灌注8小时。试验动物分为假手术对照组,缺血/再灌注(I/R)损伤模型组,负压封闭引流干预的缺血/再灌注损伤模型组(I/R+VSD组),每组12只。各实验组随机选取6只大鼠,利用伊文思蓝法测定肺毛细血管渗漏情况。各组其余模型用于以下检测：①检测大鼠左后肢腓肠肌组织氧分压：②测定骨骼肌和肺组织的湿重/干重比；③骨骼肌细胞活性MTT法测定：④骨骼肌组织氧化应激指标(SOD、MDA、CAT、GSH)浓度的测定；⑤骨骼肌MPO浓度测定：⑥骨骼肌血管内皮生长因子测定；⑦骨骼肌、肺和血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α浓度测定：⑧骨骼肌和肺组织病理学评估分别采用HE染色,骨骼肌组织]HMGB1蛋白免疫组化染色以及Tunel法制片,用于观察组织形态、HMGB1蛋白表达(定性)和定位、细胞凋亡情况等;⑨在基因水平(aRNA)和蛋白水平分别检测骨骼肌、肺、血清中炎症相关蛋白HMGB1表达的情况。所有数据用SPSS 19软件进行统计学处理,数据以平均值±标准差的方式进行表述,统计分析前先验证数据正态性及方差齐性,三个试验组组间比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD法(方差齐)或Tamhane's T2法(方差不齐),氧分压数据统计使用重复测量数据方差分析,P0.05表示差异有统计学意义。结果①伊文思蓝测定VSD组大鼠肺毛细血管渗漏程度低于I/R组(t=5.289 P0.001),差异具有统计学意义。②缺血再灌注后使用VSD组干预组大鼠的骨骼肌组织氧分压在再灌注初期显著低于I/R组(P0.05),且再灌注后氧分压稳定在较低水平,有利于抑制需要氧分子参与的氧化应激反应。③VSD组大鼠骨骼肌和肺部组织的湿重／干重比显著低于1[R组(t=7.718 P0.001；t=4.427 P0.001),说明VSD组大鼠骨骼肌和肺组织水肿程度低于I/R组。④MTT结果显示VSD骨骼肌细胞的活性显著高于I/R组(t=3.059 P=0.006)。⑤氧化应激时组织过氧化损伤产物MDA在VSD组的浓度水平显著低于I/R组(t=2.212 P=0.043),而VSD组的抗氧化因子SOD、CAT和GSH的水平明显高于I/R组,差异显著(t=2.492 P=0.025；t=2.264 P=0.039;t=2.424 P=0.028)。⑥炎症指标MPO在VSD组的浓度低于I/R组,差值具有统计学意义(t=2.145 P=0.049)。⑦VEGF在I/R组和VSD组的表达水平较对照组显著增高(F=77.616 P0.001),且VSD组升高程度显著大于I/R组(t=7.459 P0.001)。⑧炎症因子IL-1p、IL-6、TNF-a浓度水平的显著差异表现为VSD组低于I/R组(P0.05)。⑨骨骼肌HE染色切片显示VSD组组织细胞间隙比例与排列情况接近正常组织,而I/R组骨骼肌细胞表现为肌纤维变性,肌细胞间隙增宽,炎症细胞浸润,两组骨骼肌损伤评分差异显著(t=6.198 P0.001)：肺组织HE切片则表现为VSD组的炎症细胞浸润、水肿和渗出的程度低于I/R组,两组肺部损伤评分差异显著(t=6.033 P0.001)；免疫组化结果显示,损伤相关蛋白HMGB1在VSD组骨骼肌中的表达明显低于I/R组：Tunel检测结果表明骨骼肌缺血再灌注损伤后局部组织细胞发生了凋亡,而VSD的干预可明显降低骨骼肌组织发生凋亡细胞的比例,表现为与/IR组比较差异具有统计学意义(t=7.177 P0.001)。⑩荧光定量PCR结果和免疫蛋白印迹Western Blot结果显示,HBGB1在VSD组的骨骼肌和肺组织的基因表达水平、蛋白表达水平均低于I/R组,差异显著(P0.05)；ELISA法测定血清HMGB1的结果也表现出相同的变化。结论持续负压封闭引流,可以移除骨骼肌组织间隙内多余的液体,减轻水肿,增加毛细血管血流灌注,负压封闭引流降低了再灌注后骨骼肌组织的氧分压和炎症因子,减轻了氧化应激和炎症反应的程度,继而改善了缺血再灌注引起的骨骼肌组织水肿、肌纤维变形、坏死,肌细胞活性下降和细胞凋亡：负压封闭引流减轻骨骼肌缺血再灌注损伤,降低血浆炎症因子,移除可以导致急性肺损伤的损伤相关蛋白分子HMGB1蛋白,继而减轻全身炎症反应和急性肺损伤。综上,负压封闭引流应用于并发血管损伤的下肢开放性骨折病人,可以促进创口愈合,减轻全身炎症反应,一定程度减少创口感染和急性肺损伤的发生率,使病人受益。通过动物试验可知,负压封闭引流通过降低骨骼肌组织氧分压,减轻骨骼肌氧化应激损伤：通过减轻组织水肿,增加骨骼肌血流灌注,缓解骨骼肌缺血再灌注时的“无复流现象”;通过减轻骨骼肌炎症反应,降低骨骼肌、血浆和肺部炎症因子以及损伤相关蛋白HMGB1的含量,从而减轻下肢IRI引发的急性肺损伤。
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（ｐｉｃｔｉｖｅ邋ｄｒａｗｅｄ邋ｂｙ邋Ｃ邋Ｈｕａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ邋２０１４）逡逑查阅文献的过程中，我们还注意到了虽然负压封闭引流在创伤骨科临床在血管损伤修复术启ＶＳＤ的使用还是一个存在争议的问题，针对ＶＳＤ作用是否会增加血管痊李、血管栓塞或者导致吻合口破裂出血等，这些的答案ＩＷ。相关研巧既有用于血管移棺术后获得良好收效的报道，又有Ｖ破裂大出血引起的致死并发症的案例。逡逑于上化ＩＲＩ的损伤机制和ＶＳＤ治疗ＩＲＩ己有的试验室报道。本研究拟开与讨论：①回顾性分析我院创伤外科收治严重下肢开放性骨折合并血管用ＶＳＤ治疗后的效果（临岕究）；②通过动物试验研究负励闭引流冉灌注损伤及其引发的急性肺损伤保护性作用的机制。逡逑

．３．１湿重／干重比法评估组织水肿程度逡逑取适当损伤部位的骨骼肌组织和肺部组织，分别称取新鲜和烘干后的重量，可Ｗ逡逑获得组织湿重／干重比，通过比较各组大鼠组织湿重／干重比，可平估缺血再灌注损伤逡逑后骨骼肌和肺姐织水肿的情况。由下图Ａ可知，Ｉ／Ｒ组骨骼肌水肿程度氋于对照组和逡逑ＶＳＤ干预组，统计学差异显著（／心％．６６７，尸＜０．００１）；而对照绝与ＶＳＤ组比较无明显逡逑差异（片０．６４５，b6＝０．５％），说明ＶＳＤ可显著改善损伤组织的水肿程度。通过图Ｂ可知，逡逑Ｉ／Ｒ组肺水肿程度明显高于对照组（户１０．６０８，户＜０．００１），，说明下肢骨骼肌缺血再灌注逡逑损伤后出现了急性肺水肿的表现；ＶＳＤ组大鼠肺水肿程度较Ｉ／Ｒ组显著减轻（户４．４２７，逡逑户＜０．００１），但仍氋于对照组，说明ＶＳＤ在一定程度上缓解下肢缺血再灌注导致的急性逡逑肺损伤。逡逑
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R641


本文编号：2520846