VRACs有效阻断剂DCPIB对局灶性脑缺血后小胶质细胞介导炎症反应和神经元损伤的抑制作用

发布时间：2019-08-03 18:25

【摘要】：第一部分DCPIB减弱氧糖剥夺诱导的小胶质细胞增殖及促炎因子的分泌 目的：研究氧糖剥夺后DCPIB对小胶质细胞增殖及促炎症因子分泌的影响 方法：采用中国医学科学院细胞中心购买的小胶质细胞BV-2细胞系,将冻存BV-2细胞系经过复苏后种植于多聚赖氨酸包被的24孔塑料培养板中,随机将小胶质细胞分组为对照组、OGD组及OGD+DCPIB组,然后将OGD组及OGD+DCPIB组培养基更换为无糖无血清培养基,同时OGD+DCPIB组给予DCPIB(10μM),置于2%O2的缺氧培养箱l0min后,更换为高糖及无血清培养基并置于37℃、5%CO2常规培养箱3h,然后应用免疫荧光技术将小胶质细胞固定、破膜、封闭、加一抗OX-42与Ki67、TNF-α、IL-Iβ三种分别双染,过夜与4℃冰箱,并次日分别均加三组双染的一抗用二抗CY3及FITC标记的IgG双染,并避光荧光显微镜拍照。计算小胶质细胞细胞Ki67、TNF-α及IL-I β阳性率。运用统计学软件SPSS19.0进行数据统计分析。 结果：小胶质细胞的Ki67阳性表达于胞核上；与对照组相比,OGD组OX-42阳性的小胶质细胞Ki67表达明显升高(P0.01,n=6)：而在OGD+DCPIB组OX-42阳性的小胶质细胞的Ki67表达则较之OGD组明显下降(P0.01,n=6)。与对照组相比,10minOGD组小胶质细胞TNF-α、IL-Iβ表达百分率明显升高；而在OGD+DCPIB组小胶质细胞的TNF-α、IL-Iβ表达则较之OGD组明显下降。 结论短暂的氧糖剥夺可以增强小胶质细胞的活化及增殖,而在氧糖剥夺前给予DCPIB干预可以减弱小胶质细胞的增殖能力,抑制小胶质细胞分泌上述两种炎症因子。 第二部分DCPIB抑制氧糖剥夺引起的小胶质细胞迁移 目的研究氧糖剥夺后DCPIB对小胶质细胞迁移的影响 方法小胶质细胞BV-2细胞系种植于6孔塑料培养板中待细胞汇集度达到80%时,随机将小胶质细胞分组为对照组、OGD组及OGD+DCPIB组,用无菌注射器头按相同的坐标位置划痕小胶质细胞形成空白划痕,对照组培养基为无血清高糖培养基37℃、5%C02常规培养箱,同时将OGD组及OGD+DCPIB组培养基更换为无糖无血清培养基,同时OGD+DCPIB组给予DCPIB(10uM),置于2%02的缺氧培养箱10min后,更换为高糖及无血清培养基并置于37℃、5%C02常规培养箱48h,然后应用倒置相差显微镜拍摄小胶质细胞迁移的面积。NIH Image J软件计算OGD后3,6,12,24,和48h划痕造成的空白面积,运用统计学软件SPSS19.0进行数据统计分析。 结果：划痕48h后,OGD组小胶质细胞划痕空白的面积较之空白对照组明显缩小(P0.01,n=6)；而在OGD+DCPIB组,则较之OGD组划痕空白的面积明显大(P0.O1,n=6)。 结论短暂的氧糖剥夺可以导致小胶质细胞迁移能力增强,而在氧糖剥夺前给予DCPIB干预可以抑制小胶质细胞的迁移能力。 第三部分DCPIB抑制离体及活体状态下缺血再灌注后小胶质细胞介导的神经元损伤 目的研究离体及活体状态下DCPIB对缺血条件下神经元的保护作用 方法采用上述BV-2细胞系种植于Transwell、室,而将取自小鼠海马的原代神经元培养于24孔塑料培养板7d后,将小胶质细胞/神经元共培养体随机分组为对照组、OGD组及OGD+DCPIB组,然后将OGD组及OGD+DCPIB组Transwell小室的上层培养基更换为无糖无血清培养基,同时OGD+DCPIB组于小室上层培养基中给予DCPIB(10uM),置于2%O2的缺氧培养箱l0min后,OGD组及OGD+DCPIB组Transwell小室的上层培养基更换为高糖及无血清培养基并置于37℃、5%CO2常规培养箱3h。同样在SD大鼠分为对照组、rMCAO组及rMCAO+DCPIB组(250g,n=5),将颈内动脉栓塞1h后,拔除栓子再灌注3d形成rMCAO模型,而rMCAO前脑室内给予10u1的DCPIB (1mM)后,再形成rMACO模型,为rMCAO+DCPIB组。免疫荧光染色神经元。计算神经元在离体及活体情况下各组存活阳性率,运用统计学软件SPSS19.0进行数据统计分析。 结果与对照组相比,10minOGD组神经元NeuN阳性表达明显下降(P0.01,n=6),而在OGD+DCPIB组神经元NeuN阳性表达则较之OGD组明显增高(P0.01,n=6)；活体rMCAO'情况下,大鼠海马区CA1神经元死亡较对照组多,而在rMCAO+DCPIB组神经元存活率高于rMCAO组。 结论DCPIB可以抑制活体和离体状态下缺血再灌注后小胶质细胞介导的神经元的死亡 第四部分DCPIB通过MAPK通路抑制小胶质细胞的活化 目的研究DCPIB对脂多糖或氧糖剥夺诱导的小胶质细胞活化通路的影响 方法将小胶质细胞BV-2细胞系种植于玻璃培养瓶中,随机将小胶质细胞分组为对照组、LPS组及LPS+DCPIB、LPS+PD98059组、LPS+SB203580组.PS+SP600125组(n=4),然后将LPS组及LPS+DCPIB组培养基更换高糖无血清培养基并加LPS(10μg/ml)后培养2h前,同时将LPS+DCPIB组、LPS+PD98059组、LPS+SB203580组及LPS+SP600125组分别给予DCPIB、PD98059、SB203580及SP600125(10uM),各组收集小胶质细胞并提取总蛋白,利用Western blot获取各组p-ERK1/2、p-JNK及p-p38表达；同样,将小胶质细胞BV-2细胞系种植培养瓶中,随机将小胶质细胞分组为对照组、OGD组及OGD+DCPIB组,然后将OGD组及GD+DCPIB组培养基更换无糖无血清培养基后置于2%O2的缺氧培养箱l0min后,然后分别更换为高糖及无血清培养基并置于37℃、5%CO2常规培养箱培养,在常规培养箱培养0、0.5h、1h、3h及6h后,以上述Western blot,各组收集小胶质细胞并提取总蛋白,获取各组不同时间点p-ERK1/2、p-JNM及p-p38蛋白表达。将各组表达的不同激酶p-ERK1/2、p-JNK及p-p38经暗室曝光,运用统计学软件半定量分析,SPSS19.0进行数据统计分析。 结果与对照组相比,LPS组小胶质细胞的MAPK通路三个激酶p-ERK1/2、p-JNK及p-p38表达明显升高(PO.01,n=4)；而LPS+DCPIB组与LPS组比较,p-ERK1/2、p-JNK及p-p38表达则明显下降(P0.05,n=4)；而LPS+PD98059组较LPS组小胶质细胞的p-ERK1/2表达明显下降(P0.05,n=4),LPS+SB203580组较LPS组小胶质细胞的p-p38表达亦明显下降(P0.05,n=4),PS+SP600125组较LPS组小胶质细胞的p-JNK表达同样明显下降(P0.05,n=4)；而OGD后小胶质细胞的p-ERK1/2、p-JNK及p-p38分别在OGD后30、15和30mmin表达明显升高至最高峰(P0.05,n=6),而OGD+DCPIB组p-ERK1/2、p-JNK及p-p38较OGD组表达明显下降(P0.05,n=6)。 结论DCPIB通过MAPKs信号通路对小胶质细胞活化抑制。
【图文】：

图1小胶质细胞系BV-2的0X42 (CDllb)和Ki67的表达。（A)对照组组BV2 (A1 - 2),OGD (B1, lOmin)和 OGD+DCPIB (CI, 10 Ji M)。BV2 特异性抗体 OX-42 (红色)? Al,B1和CI分别代表上述不同条件下核蛋白Ki67的表达。A2、B2和C2是0X-42(红色）、Ki-67 (绿色）和DAPI (蓝色）三者的合成图片.一过性氧糖剥夺导致了Ki67的表达升高(B1-2)，，而这一效应被DCPIB抑制（C1-2). (D) Ki-67染色阳性的 BV-2 细胞定量分析。**p〈0.01, OGD vs 对照组；p〈0. 01, DCPIB vs OGD 组(n=6)o

图2 DCPIB对氧糖剥夺诱导的BV2分泌的炎症性因子(TNF-a和IL-l)影在对照组条件下的的TNF-a的表达1(A1 -2)，10 min 一过性氧糖(A3-4)OGD+10 IX M DCPIB (A5-B)后再灌注 3 h。A2, A4 和 A6 是 T色)/DAPI (蓝色）染色的合成图片。B. BV2在对照组条件下的的IL-e的-2)，10 min 一过性氧糖剥夺 OGD (B3-4)或者 0GD+10 u M DCPIB (B5 - 注3 ho B2, B4和B6是IL-e (绿色)/DAPI (蓝色）染色的合成图片。剥夺后TNF-a和IL-le表达均明显增加(A4和B4)。VRACs通道阻滞剂D了这种病理性改变(A6和B6)。34
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15

【参考文献】

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本文编号：2522716