脐带间充质干细胞对重度烧伤大鼠肾脏及肺保护作用的研究

发布时间：2019-10-18 17:09

【摘要】：严重烧伤可造成全身多脏器损伤和功能下降，特别是烧伤合并多器官功能障碍综合征，是导致病人死亡的主要原因。虽然烧伤后各器官结构和功能损伤的确切机制仍然不完全明了，但诸多研究表明，烧伤后局部微环境改变与组织器官修复和再生关系密切；特别是缺血、缺氧及炎性介质大量释放和氧自由基产生是导致多器官功能衰竭的重要原因。目前已有研究表明在受损后应用间充质干细胞可以有效改善损伤局部微环境，从而促进细胞活性以及修复损伤组织。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有增殖和多向分化潜能的一类多能干细胞，可从胎儿血液、肝脏、骨髓、脂肪等多种组织获得，是一群多潜能细胞，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化。临床上利用MSCs移植治疗某些疾病也已取得较好效果。目前，，在针对组织再生与修复的各项研究中，自体骨髓间充质干细胞(Bonemarrow derived-MSCs，BMMSCs)的研究和应用最为广泛，在体修复损伤组织的技术方法已经建立及得到应用。然而，骨髓间充质干细胞的获取须行骨髓穿刺术，给供者造成一定痛苦，且骨髓间充质干细胞的增殖及分化潜能随供者年龄的增大而下降。而且以往对MSCs的应用在损伤组织再生修复研究中仅限于后期的治疗，在急性烧伤等需早期治疗中往往受到细胞培养周期的限制而无法及时使用。因此寻找新的MSC来源成为国内外干细胞研究领域的热点。目前，脐带来源间充质干细胞(umbilical cord derived-MSCs，UCMSCs)的多向分化潜能已得到证实，而且具有来源广泛、免疫反应低、分化潜能大等多种优势，因此，可以将UCMSCs作为一种崭新的细胞治疗策略应用于烧伤后器官损伤修复再生研究。严重烧伤所导致的不同脏器损伤的发生与发展与严重程度也不尽相同，其中肾脏组织损伤是较早出现的并发症。肾脏组织损伤的发生与多种细胞因子、嘌呤池耗竭、自由基的生成增多和清除能力减弱、能量代谢障碍、细胞凋亡和坏死等多种因素的作用有关。近期研究表明MSCs能够参与炎症组织的细胞迁移，并通过产生多种再生因子，引起组织及浸润在黏膜内活化的巨噬细胞失活，并通过促进宿主自身细胞增殖修复损伤组织。这也提示UCMSCs可能对早期重度烧伤动物具有较好的保护效应。为探讨UCMSCs在严重创伤后具体器官或组织中的具体作用以及其机制，本研究采用重度烧伤大鼠模型，观察UCMSCs对伤后肾脏可能产生的作用，为UCMSCs应用于烧伤后肾脏损伤的保护及机制研究奠定基础。另外，烧伤后的急性肺损伤是伤后导致的急性进行性缺氧性呼吸功能不全，也是导致患者死亡的主要原因。但由于肺部结构的复杂性和易感染性，目前干细胞用于治疗肺部疾病的研究落后于其他器官。已有文献证实肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）等炎性介质的合成释放,中性粒细胞等在肺内积聚,补体激活,氧自由基产生等所导致的一系列病理改变在其发病机制中起重要作用。基于此，本研究采用烧伤与细菌感染的双重模型，试图探讨UCMSCs对创伤后急性肺损伤的保护效应及可能机制。本研究结果有望为干细胞应用于烧伤后脏器的损伤保护及其机制研究奠定实验基础。本实验主要由以下三部分内容组成：一、分离培养获取UCMSCs及对其细胞生物学特性实验研究。在本实验中，采用胶原酶消化与组织贴壁相结合的方法，分离获取脐带沃顿胶（Wharton’s Jelly）来源的间充质干细胞，采用流式细胞术检测细胞的表面抗原的表达、分析细胞的增殖活性；同时采用细胞化学法鉴定细胞的多向分化潜能（脂肪、骨及软骨细胞）。结论：脐带沃顿胶（Wharton’ Jelly）中分离、提取的UCMSCs阳性表达间充质干细胞标记物抗原（CD29、CD44、CD90、CD105），阴性表达造血细胞系标记物CD34。UCMSCs能够分化为碱性磷酸酶染色阳性的骨细胞、II型胶原抗体染色阳性的软骨细胞以及油红-O染色阳性的脂肪细胞。经四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）检测法发现，UCMSCs具有较强的细胞增殖能力。二、UCMSCs对重度烧伤大鼠肾脏保护作用的研究。在本实验中，取已获取并鉴定的P3-P7代UCMSCs静脉注射20%总体表面积（total body surface area，TBSA）III度烧伤大鼠模型：其中以乌斯他汀治疗为阳性对照组、注射等量体积的生理盐水组为阴性对照组。烧伤后大鼠模型愈合后，用冰冻切片法与免疫组织化学染色法在荧光显微镜下观察UCMSCs在大鼠肾脏中分布特征，生化试验检测其修复治疗的治疗效果。结论：经与阳性对照组、阴性对照组比较后发现，烧伤后7、14d的组织病理学观察显示，干细胞移植后的大鼠烧伤后肾脏组织充血、肿胀等病理学改变较乌司他丁组及生理盐水组有所减轻，随时间延长减轻更加明显；免疫组化观察显示UCMSCs组伤后7d和14d肾组织中Bcl-2的表达较乌司他丁组和生理盐水组明显增多，表明肾组织抗凋亡能力增强。大鼠烧伤后血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（creatinine，Cr）均较正常对照组显著升高。乌司他丁治疗组7d和14d BUN和Cr较生理盐水组均明显下降。UCMSCs组伤后7d和14d BUN和Cr均明显下降，与生理盐水组和乌司他丁组比较差异均有显著性（P0.05），显示干细胞治疗对肾功能有明显改善作用。UCMSCs移植可有效减轻重度烧伤后大鼠肾脏组织的损伤并改善肾脏功能。三、UCMSCs对创伤后早期急性肺损伤作用的研究在本实验中取已获取并鉴定的P3-P7代UCMSCs静脉注射20%TBSAIII度烧伤大鼠模型（注射大肠杆菌内毒素）：其中以乌斯他汀治疗为阳性对照组、注射等量体积的生理盐水组为阴性对照组、注射UCMSCs为实验组。采用冰冻切片法与免疫组织化学染色法在荧光显微镜下观察UCMSCs在大鼠肺中分布特征，生化试验检测其修复治疗的治疗效果。结论：经与阳性对照组、阴性对照组比较后发现，烧伤后7、14d的组织病理学观察显示，脐带间充质干细胞能改善创伤性急性肺损伤动物的血气，不同程度降低外周血TNF-α及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavage fluid，BALF）中TNF-α、C3a、C5a和白蛋白含量,抑制肺组织TNF-α的蛋白表达，减轻内脏组织的损伤程度。病理学观察干细胞移植后的大鼠烧伤后肺组织充血、肿胀等病理学改变较乌司他丁组及生理盐水组有所减轻，随时间延长减轻更加明显。证明脐带间充质干细胞能减少组织及血浆TNF-α的生成及含量，降低TNF-α等细胞因子介导的多器官组织损害,在一定程度上对创伤后早期急性肺损伤起保护作用，并缓解MODS的发生发展。
【图文】：

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解放军医学院硕士学位论文采用酶解法和组织块贴壁培养法由人脐带沃顿胶(Wharton’s Jelly)中分离提取的原代间充质干细胞（hUCMSCs）多于 24-48h 内贴壁；培养 3-5 天后，倒置显微镜下可见贴壁生长的细胞呈梭形、多角形。随着培养时间的延长，可见细胞呈成纤维细胞样克隆性增殖，细胞大小较均一，以梭形细胞为主，呈平行或漩涡状生长，经过 10-14 天的培养后融合率可达 80-90%（见图 3.1）。

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图 3.2 流式细胞术检测脐带间充质干细胞（hUCMSCs）的抗原表达特征。hUCMSCs 阳性达：CD29、CD44、CD90、CD105、Oct-4；阴性表达：CD34。（三）脐带间充质干细胞多向分化潜能人脐带间充质干细胞在进行多向分化诱导前一般呈梭形、成纤维细胞样hUCMSCs 在成骨分化诱导培养基培养 21 天后，经钙钴法碱性磷酸酶染色可见胞染色呈黑色，黑色颗粒大小不一，提示有钙化颗粒形成，未在成骨诱导培养中培养的对照组细胞碱性磷酸酶染色结果为阴性。UCMSCs 经脂肪诱导培养基养 21 天后显微镜下可见细胞胞浆内有脂滴形成，用油红-O 染色结果为阳性，而经过脂肪诱导在普通间充质干细胞培养基中培养的细胞无脂滴形成，油红-O 染阴性。hUCMSCs 在软骨分化诱导培养基中培养 2-3 周后，采用免疫组织化学法测 II 型胶原抗体时发现，细胞胞浆染色呈棕黄色，而未经软骨分化诱导培养基导的细胞免疫组织化学染色结果为阴性，提示无软骨细胞形成（见图 3.3）。
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R644

【参考文献】