促红细胞生成素对创伤性颅脑损伤神经保护作用的研究及Meta分析

发布时间：2020-01-27 02:16

【摘要】：本研究通过大鼠液压创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)模型,从组织细胞学到神经行为学两个层面研究促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对TBI大鼠的神经保护作用；并通过内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress,ERS)和自噬两个途径探讨EPO对TBI神经保护作用的可能机制；进一步采用meta分析的方法评价EPO治疗临床TBI患者的安全性和有疗效。本论文的研究结果表明：EPO显著降低TBI后大鼠损伤皮层和海马细胞凋亡,改善大鼠长期神经功能,促进神经功能恢复；ERS及caspase-12介导的凋亡的抑制,和自噬水平的上调可能是EPO神经保护作用的重要机制；Meta分析证明临床上EPO治疗TBI患者是安全且有显著效果的,可以显著降低患者死亡率,显著缩短患者住院时间,同时并不增加患者植物生存的发生率和深静脉血栓的发生风险。第一部分促红细胞生成素对TBI大鼠神经保护作用的研究目的：采用大鼠液压损伤TBI模型研究EPO治疗对TBI后大鼠皮层和海马细胞凋亡的影响,探讨EPO治疗是否能够改善TBI大鼠长期神经功能。方法：成年雄性SD大鼠随机分为四组：假手术组(Sham组) 假手术后给予EBO治疗组(EPO组)、脑外伤组(TBI组)和脑外伤后EPO治疗组(TBI+EPO组)。采用液压脑损伤方法制作大鼠TBI模型,外伤后6小时腹腔注射EPO (5,000 U/kg).分别从组织病理学和神经行为学评估EPO治疗对TBI的神经保护作用：TBI后24小时采用TUNEL染色的方法观察各组损伤皮层和海马CA1区阳性染色细胞率,采用western blot的方法观察各组皮层和海马组织caspase-3的表达水平；使用改良神经功能评分(modified neurological severity score, mNSS)评估每组大鼠干预后1天、4天、7天、14天、21天、28天和35天的神经功能。结果：Western blot和TUNEL染色结果显示,外伤后24小时损伤皮层和海马细胞凋亡水平上升,EPO治疗能显著降低细胞凋亡(p0.05); mNSS评分结果提示TBI后1天,mNSS评分显著上升,并持续至伤后35天仍显著高于Sham组(p0.05),而EPO治疗在TBI后7天直至到伤后35天均能显著降低mNSS评分(p0.05)。结果提示EPO治疗能够显著降低TBI后神经细胞凋亡,改善长期神经功能。结论：TBI可诱导皮层和海马神经细胞凋亡,并且损害大鼠长期神经功能。外源性EPO治疗能够显著降低皮层和海马细胞凋亡,并改善TBI后大鼠的长期神经功能；初步证实了EPO对TBI大鼠有明确的神经保护作用。第二部分内质网应激反应介导的细胞凋亡在促红细胞生成素对大鼠TBI神经保护中的作用和机制目的：第一部分证实EPO治疗能够显著降低TBI后细胞凋亡并改善长期神经功能。本部分研究EPO治疗对大鼠TBI后损伤皮层内质网应激反应的作用,探讨内质网应激反应和caspase-12介导的凋亡在EPO神经保护中的作用和机制。方法：成年雄性SD大鼠随机分为四组：Sham组、EPO组、TBI组和TBI+EPO组。采用液压脑损伤方法制作TBI模型,外伤后6小时腹腔注射EPO (5,000 U/kg),外伤后24小时将大鼠处死。分别采用western blot和免疫荧光染色的方法检测各组大鼠TBI后24小时损伤皮层内质网应激反应相关蛋白caspase-12、CHOP和BIP表达水平的改变。探讨EPO治疗TBI后内质网应激反应水平和caspase-12介导的凋亡的改变及其与EPO神经保护作用的关系。结果：Western blot结果显示,外伤后24小时,TBI组损伤皮层的内质网应激反应相关蛋白caspase-12、CHOP和BIP的表达水平较Sham组显著提高(p0.05)；相较于TBI组,EPO治疗能够显著下调皮层caspase-12和CHOP表达水平(p0.01),上调BIP的表达水平(p0.05)。免疫荧光染色结果提示,外伤后24小时,TBI组皮层的caspase-12、CHOP和BIP染色阳性细胞细胞率较Sham组显著提高(p0.001)；外伤后EPO治疗可以进一步提高BIP染色阳性细胞率(p0.01),降低caspase-12和CHOP染色阳性细胞率(p0.01)。结论：TBI可诱导损伤皮层内质网应激反应,而EPO治疗能显著抑制皮层的内质网应激反应；EPO可能通过抑制TBI后内质网应激反应和caspase-12介导的凋亡发挥其神经保护作用。第三部分自噬在促红细胞生成素对TBI大鼠神经保护中的作用和机制目的：本研究前面部分已经证明,EPO可以显著降低TBI后细胞凋亡并改善TBI大鼠长期神经功能,ERS及caspase-12介导细胞凋亡的抑制可能在其中发挥重要角色。ERS和自噬有着紧密的联系,相互作用共同在TBI后发挥重要作用,而自噬在EPO治疗中的作用尚未有报道,本研究观察自噬水平在EPO治疗TBI后的变化,并探讨自噬否参与EPO对TBI的神经保护作用。方法：成年雄性SD大鼠随机分为四组：Sham组、EPO组、TBI组和TBI+EPO组。采用液压损伤方法制作TBI模型,外伤后6小时腹腔注射EPO (5,000 U/kg)。外伤后24小时将大鼠处死,分别采用western blot和免疫荧光染色的方法检测各组大鼠损伤皮层自噬相关蛋白LC3、ATG5、Beclin-1和P62表达水平的改变。探讨EPO治疗TBI后自噬水平的改变及其与EPO神经保护作用的关系。结果：Western blot结果显示,外伤后24小时,TBI组的自噬相关蛋白LC3、ATG5和Beclin-1的表达水平较Sham组显著提高,P62的表达水平较Sham组明显下降(p0.05); TBI+EPO组LC3、ATG5和Beclin-1的表达水平较TBI组有显著提高,而P62的表达水平较TBI组进一步下降(p0.05)。免疫荧光染色结果提示,外伤后24小时,TBI组LC3、ATG5和Beclin-1染色阳性细胞细胞率较对照组显著提高(p0.05)；外伤后EPO治疗可以进一步提高LC3、ATG5和Beclin-1染色阳性细胞率(p0.05)。结论：TBI可诱导损伤皮层神经细胞自噬水平上调；EPO治疗TBI可以进一步提高损伤皮层神经细胞的自噬水平；自噬可能参与了EPO治疗TBI的神经保护机制。第四部分促红细胞生成素治疗TBI的安全性和有效性：基于临床随机对照试验的Meta分析目的：EPO在TBI动物模型中发挥神经保护作用,然而EPO对于临床TBI患者的治疗作用尚不明确。本研究的目的是对EPO治疗TBI患者的安全性和有效性进行系统评价和Meta分析,以明确EPO对TBI患者的临床治疗价值。方法：利用计算机检索PubMed, Web of Science, MEDLINE, Embase,和Cochrane图书馆临床对照试验数据库,同时通过手工检索相关系研究文献的参考文献作为补充。检索日期为自建库至2016年1月1日,检索已公开发表的研究EPO治疗TBI患者的随机对照研究(randomized controlled trials, RCTs)o观测的结局指标包括：神经功能预后良好率、死亡率、植物生存率、住院时间以及相关的药物不良反应发生率。连续变量采用平均差(mean difference, MD )和95%置信区间表示；二分类变量采用相对危险度(risk ratio, RR)或风险差(risk difference, RD )和95%置信区间表示;采用I2和卡方检验检测纳入研究的统计学异质性。结果：按照检索策略共查到346篇文献,最终5个RCTs,包括915例患者符合标准并纳入研究。其中研究神经功能预后良好率的文献2篇,研究死亡率的文献5篇,研究植物生存率的文献2篇,研究住院时间的文献2篇,研究深静脉血栓的文献4篇。Meta分析结果显示：对于TBI患者,EPO治疗可以显著降低死亡率(RR=0.69; 95%CI=0.49, 0.96; p=0.03)并缩短住院时间(MD=-7.59; 95% CI=-9.71,-5.46; p0.0001); EPO治疗对于神经功能预后良好率(RR=1.00, 95% CI=0.88, 1.15, p=0.97),植物生存率(RR=1.13; 95% CI=0.53, 2.42; p=0.75)和深静脉血管发生率(RD=0.00, 95% CI=-0.05, 0.05, p=1.00)无显著影响。结论：EPO治疗TBI患者是有显著临床效果的,表现为显著降低患者死亡率,并且不以增加患者植物生存的发生率为代价,EPO治疗可以显著缩短患者住院时间；EPO治疗是安全的,并不增加患者深静脉血栓的发生风险。但是EPO治疗并不显著改善患者的神经功能预后,因此,尚需要更多的设计良好的、多中心、大样本RCTs进一步明确EPO治疗TBI患者的最佳药物剂量、给药策略和给药时间窗。
【图文】：

示意图,信号通路,神经保护作用,脊髓缺血

图１．１邋ＥＰＯ／ＥＰＯ－民神经保护作用的信号通路示意图［３０Ｊ逡逑动物实验方面，近期多项研究显示，在脑、脊髓缺血后再灌注、低氧缺血环逡逑

促红细胞生成素,皮层,大鼠,皮层细胞

２．３实验结果逡逑２．３．１皮层神经细胞调亡检测逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ结果见图２．１所示，Ｓｈａｍ组和ＥＰＯ组中，皮层ｃａｓｐａｓｅ－３呈少量逡逑表巧；与Ｓｈａｍ组相比，ＴＢＩ后２４小时损伤皮层组织的ｃａｓｐａｓｅ－３表巧水平呈显著逡逑性上调（１．６３±０．１１邋ＶＳ邋ｓｈａｍ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｐ＜０．０５）；与邋ＴＢＩ邋组相比，ＴＢＩ邋后邋６邋小时给予邋ＥＰＯ逡逑治疗显著降低损伤皮层ｃａｓｐａｓｅ－３表这水平（１．６３±０．１１邋ＶＳ邋１．１９±０．０７，ｐ＜０．０５）。统计逡逑结果提示ＥＰＯ对ＴＢＩ损伤皮层细胞有显著的保护作用。逡逑Ｓｈａｍ邋ＥＰＯ邋ＴＢＩ邋ＴＢＩ＋ＥＰＯ逡逑Ｃａｓｐａｓｅ－３邋Ｉ逡逑Ｍｌ邋ｔｉＭ逡逑Ｉ邋ｉｍｐ逦哪圃＾，逡逑？逡逑（逦Ｉ逡逑工逦★逡逑0邋．逦，，逡逑曼２．0１逡逑Ｏ逡逑－巧逦下逡逑芝器１．５－逡逑＂玄逦W 逦Ｔ逡逑Ｃ邋Ｗ逦￣逦：逦ｒ＾ＴＴＴＴ＾逡逑鲁巧１．０－幌p邋ｔ：■定巧逡逑巧■§逦辑强逡逑0邋Ｓ逦试逦＂逡逑Ｘ邋０）邋口．５－逦：；：：：：：：：：：：：：：：：；：：：；：逦—…逡逑山。逦坦战：逡逑0邋０．０邋Ｊ邋心；中甲扣；－；３逦１＂邋ｆ邋Ｉ邋ｄ逦【Ｔ－邋■逦…甲－逡逑ｔ邋《《务令务逡逑图２．１促红细胞生成素对ＴＢＩ大鼠皮层ｃａｓｐａｓｅ－３表这水平的影响，＊邋Ｐ＜０．０５逡逑１４逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.15

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