依达拉奉对急性呼吸窘迫综合征早期肺纤维性增生的影响及作用机制研究

发布时间：2020-03-26 08:24

【摘要】：背景急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是继发于感染、创伤及休克等多种病理损伤的临床综合征,以进行性低氧血症和呼吸困难为主要临床表现。2012年柏林定义中ARDS轻、中、重度患者死亡率分别达27%、32%和45%,肺部进行性纤维增生是影响ARDS患者存活率及预后的一个重要因素。但是至今ARDS肺纤维性增生进程及其机制尚未完全阐明,且没有理想的治疗方法。因此,对ARDS肺纤维化发生机制和有效药物的研究具有非常重要的科学价值。有研究表明转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是导致纤维化的关键因子,Smads信号传导通路在纤维化的发展进程中同样重要。同时越来越多研究显示氧化应激是肺纤维化的重要机制之一,而在ARDS的病程中,自由基尤其氧自由基等氧化应激反应对疾病发展有重要意义,如能早期促进氧自由基清除,或许可抑制肺纤维化,改善ARDS预后。依达拉奉(edaravone,EDA)是强效自由基清除剂,在急性脑梗死患者中已广泛应用。近年来发现它对肺损伤也有保护作用。因此,我们通过构建脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠ARDS模型,从病理学、分子生物学角度探讨EDA能否通过抗氧自由基效应,在ARDS早期抑制肺纤维性增生,并阐明其可能的作用机制。目的探讨EDA调控TGF-β1/Smads信号传导通路的作用机制,可进一步阐明氧化应激在ARDS早期肺纤维性增生的作用,为该领域的基础研究和临床治疗提供依据。方法96只雄性SD大鼠,随机分为三组(n=32):假手术组(Sham组)、脂多糖组(LPS组)和脂多糖+依达拉奉组(简称EDA组),各组再分为1、7、14和28天共四个时间点,每个时间点每组8只。LPS组及EDA组经尾静脉予注射LPS 5mg/kg,Sham组用同样方法给予等容量生理盐水。在注射完LPS后,EDA组即经腹腔内注入EDA 6mg/kg进行干预,并用同样剂量连续给药7天。Sham组和LPS组则在相应观察时间点予等容量生理盐水腹腔注射。大鼠在各观察点腹腔注射2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉,经心脏取血后处死大鼠,测量双肺湿重,计算肺指数,留取肺组织待检。肺组织用甲醛固定,石蜡包埋,然后行苏木素-伊红(hematoxylin-eosine,HE)染色,观察病理性炎症改变;Masson染色,评估纤维性增生的分布;免疫组化观察α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin proteins,α-SMA)及胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ,ColⅠ)表达水平。肺组织中羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量采用碱水解法检测。采用RT-qPCR和WB法分别检测肺组织中TGF-β1 mRNA、Smad3和Smad4蛋白表达水平。ELISA法测定肺组织ColⅠ,TGF-β1,TNF-α和IL6含量。用硫代巴比妥酸(TBA)法、黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)及比色法分别检测肺组织中MDA,SOD和GSH-PX的表达。结果1.大鼠一般情况:Sham组大鼠对刺激反应灵敏,活动正常,呼吸平顺,摄食、饮水正常,毛色光泽,体重逐渐增加;LPS组反应逐渐迟钝,活动减少,弓背蜷缩在笼子一角,呼吸加快、加深,摄食和饮水量减少。上述异常表现,LPS组可持续约7天,EDA组可持续约5天,随后对刺激的反应逐渐变好,体重渐渐增加,活动增多。2.肺指数:与Sham组相比,LPS组大鼠相应时间点肺指数明显增加;与LPS组相比,从第7天开始,EDA组大鼠肺指数有一定程度的下降,差异有统计学意义。3.病理形态学:Sham组大鼠肺组织结构清晰,肺泡间隔正常,无炎症细胞浸润,无充血、水肿等。与Sham组相比,LPS组肺泡间隔水肿,肺泡壁明显增厚,泡壁中可见有明显的炎性细胞浸润,部分肺泡代偿性扩张,各级支气管壁周有胶原纤维沉积,肺泡壁有局灶性的纤维性增生,未见有弥漫性肺纤维化形成。与LPS组比较,EDA组肺组织炎症及纤维性增生的程度有不同程度的改善。4.TGF-β1/Smads信号传导通路:与Sham组比较,LPS组大鼠肺组织TGF-β1mRNA,Smad3和Smad4蛋白表达水平,以及血清中TGF-β1蛋白表达量均有明显上升。与LPS组对比,EDA组在同时间点TGF-β1 mRNA,TGF-β1,Smad3和Smad4蛋白有不同程度的下降。5.炎性因子表达:LPS组和EDA组大鼠血清中TNF-α,IL-6含量在第1天就有明显上升,之后又逐渐降低。与同时间点Sham组比较,LPS组TNF-α,IL-6含量均明显增加;与LPS组相比,EDA组TNF-α,IL-6含量有明显减少。6.氧化应激反应标志物:LPS组和EDA组大鼠在1天后,肺组织MDA含量均明显升高,以第7天含量最高,之后又逐渐降低。与同时间点的Sham组比较,LPS组大鼠肺组织MDA含量明显增加;EDA组与同时间点的LPS组相比,大鼠肺组织中MDA含量明显减少。与Sham组比较,两种抗氧化物质(SOD,GSH-PX)在第1天开始就明显下降,LPS组SOD逐渐降低,GSH-PX在第7天降至最低,然后逐渐恢复;与LPS组相比,EDA在相同时间点SOD,GSH-PX含量均明显降低。结论在ARDS大鼠模型中,依达拉奉能有效地抑制ARDS肺部炎症及早期的纤维性增生反应,其可能的机制为通过抗氧自由基效应,改善机体炎症反应,从而抑制TGF-β1/Smads信号传导通路,继而减轻肺组织的纤维性增生。
【图文】：

肺指数,大鼠,断尾,饮水量

蜷缩在笼子一角，呼吸加快、加深，摄食和饮水量减少。上述持续约 7 天，EDA 组可持续约 5 天，随后对刺激的反应逐渐体重逐渐增加。两组大鼠在第 5 天后，有部分出现断尾。变化情况表 15 三组大鼠不同时间点肺指数变化（mg/g, n=8, x—±s） 1d 7d 14d 组 6.78±0.23 5.94±0.29 5.95±0.39 5组 8.45±0.34**11.25±1.07**12.20±0.41**13组 8.09±0.46 9.31±0.72##10.17±0.84##11ham 组相比，**p＜0.01；与 LPS 组比较，##p＜0.01；Sham 组：假手术糖组；EDA 组：依达拉奉组

HE染色,大鼠,肺泡,肺泡壁

3. 肺组织炎症和纤维性增生的判定3.1 HE 染色结果Sham 组大鼠肺内结构清晰，肺泡间隔无增厚，无充血、水肿，无炎症细胞浸润，各时间点均无明显病理改变。LPS 组第 1 天可见肺毛细血管充血，，肺泡间隔水肿，肺泡壁明显增厚，泡壁中可见有明显的炎性细胞浸润，部分肺泡代偿性扩张，细支气管中上皮细胞有些脱落。第 7 天炎症表现最明显，可见纤维母细胞增生，部分肺泡壁中开始出现纤维结缔组织，少量淋巴细胞浸润。第 14 天肺炎症有减轻，肺组织结构破坏，可见新生的纤维母细胞灶，肺泡间隔断裂并增厚。第 28 天肺泡结构紊乱，可见胶原纤维增生明显。EDA 组与同时间点的 LPS 组相比较，在第 1 天无明显区别，其它时间点肺组织病理变化有不同程度的改善。（见图 2）
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563.8

【相似文献】