内皮祖细胞移植通过miR-141-3p-Notch-Nrf2轴减轻百草枯中毒所致急性肺损伤的研究

发布时间：2020-04-24 20:11

【摘要】：目的:百草枯(paraqut,PQ)是一种非选择性高效触杀型有机杂环类除草剂,又名克无踪,目前在全世界范围内广泛应用于农业生产中。其具有高效能、土地残留量少,对环境无污染等优点,但百草枯对人和哺乳动物有剧毒。肺脏是百草枯中毒的主要靶器官,主要表现为早期的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS),晚期的肺间质纤维化,被称为“百草枯肺”。早期的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合症是百草枯中毒的主要死亡原因。目前临床治疗仍采取对症支持方法,无特效解毒剂,疗效甚微。因此,如何修复百草枯中毒所致急性肺损伤(paraqut-induced acute lung injury,PQ-ALI)是临床关注的重点。干细胞移植是目前修复学的前沿研究,特别是成体干细胞具有取材方便、不涉及伦理等优点,在近年的研究中取得了突破性进展,但在急性肺损伤的研究中仍处于起步阶段。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)是成体干细胞的一种,能够分化成血管内皮细胞是其重要的潜能之一,在一些诱导因子的刺激下能增殖分化成为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,是血管内皮细胞的前体细胞,不仅在胚胎时期的血管发生及出生后的血管新生中发挥重要作用,而且在机体和各个器官遭受损伤后能够对损伤的血管进行再生和修复。广泛的内皮受损为百草枯中毒所致急性肺损伤早期阶段的特征性改变之一,内皮祖细胞具有潜在的内皮修复以及免疫调节功能,可能成为治疗百草枯中毒急性肺损伤的有效手段。本实验应用密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养外周血内皮祖细胞,经典的腹腔注射法建立PQ-ALI模型,旨在探讨内皮祖细胞移植对PQ-ALI的生物学作用并进一步探讨其相关机制,为百草枯中毒寻找潜在的有效治疗途径提供理论基础和线索。研究方法:1、内皮祖细胞移植对百草枯中毒所致急性肺损伤生物学作用的研究采用密度梯度离心联合贴壁培养法分离培养小鼠外周血内皮祖细胞,并从形态学及细胞表面分子标记物两个方面鉴定所提取细胞,为后期移植提供供体细胞。腹腔注射法建立PQ-ALI模型,建模成功后小鼠分为四组:Control组、EPC对照组、PQ组、EPC+PQ组,每组12只,移植后48小时处死小鼠并取肺组织,检测肺组织W/D比、肺损伤评分、ELISA法测肺组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-10水平、试剂盒检测肺组织MDA及SOD水平,探讨内皮祖细胞移植对PQ-ALI的生物学作用。2、内皮祖细胞移植通过Notch-Nrf2轴治疗百草枯中毒所致急性肺损伤的研究本部分实验拟探讨内皮祖细胞移植修复PQ-ALI的机制,采用第一部分实验中的内皮祖细胞为供体细胞,将小鼠分为四组,每组12只,分别为:Control组、EPC对照组、PQ组、EPC+PQ组,移植后48小时处死小鼠取肺组织,应用qRT-PCR检测Notch通路及Nrf2通路mRNA水平,Western-blot法检测Notch通路及Nrf2通路蛋白表达情况。后进一步在体内对Notch信号通路在RNA水平进行干扰,实验中小鼠分为四组:PQ组、PQ+EPCs组、PQ+EPCs+si-control组、PQ+EPCs+si-notch组,48小时后取肺组织检测Notch-Nrf2轴mRNA及蛋白表达水平,并同时检测肺组织W/D比、肺损伤评分及炎症因子表达等同第一部分实验中的肺损伤相关指标。3、miR-141-3p在内皮祖细胞移植治疗百草枯中毒所致急性肺损伤中发挥的作用及其相关机制探讨本部分实验旨在更进一步探讨内皮祖细胞治疗PQ-ALI的上游有关microRNA的调节机制。实验中首先取48只小鼠,建立PQ-ALI模型,分成四组:Control组、EPCs组、PQ组、EPC+PQ组,48小时后取肺组织,qRT-PCR法检测肺组织中miR-200a-3p、miR-21、miR-141-3p及miR-153水平,确定miR-141-3p为本实验的研究对象,为排除动物实验多种因素干扰,研究中更进一步在PQ处理的MLE-12中探讨miR-141-3p对Notch-Nrf2轴的调控作用,应用lipofectamine2000将miR-141-3pminic、Pre-NC以及miR-141-3pinhibitor转染入MLE-12细胞中,应用qRT-PCR以及Western-blot法检测相关分子的mRAN及蛋白表达水平。最后在体内实验中过表达miR-141-3p,探讨miR-141-3p在PQ-ALI中的作用。结果:1.密度梯度离心联合贴壁培养法成功分离培养出小鼠外周血内皮祖细胞,细胞培养一周后成典型的铺路石样改变,流式细胞仪检测细胞表面分子标记物为:CD31+CD34+Flk-1+CD45-CD133-。2.EPCs移植后小鼠肺组织W/D下降;肺损伤评分下降;肺组织促炎因子TNF-α、IL-6水平下降,抑炎因子IL-10水平升高;肺组织MDA水平下降;肺组织SOD水平升高。3.PQ-ALI时肺组织Notch-1及其下游靶基因Hers-1mRNA及蛋白表达水平受到抑制,EPCs移植后可逆转。PQ-ALI时肺组织Nrf2及其下游靶基因Hmox1及Txnrd1mRNA及蛋白表达水平受到抑制,EPCs移植后可逆转。4.体内阻断Notch-1后小鼠肺组织小鼠肺组织W/D上升;肺损伤评分上升;肺组织促炎因子TNF-α、IL-6水平升高,抑炎因子IL-10水平降低;肺组织MDA水平上升;肺组织SOD水平下降;肺组织Nrf2及其下游靶基因Hmox1及Txnrd1 mRNA及蛋白表达水平下降。5.PQ-ALI时,miR-200a-3p、miR-21表达下降,miR-141-3p及miR-153表达升高,EPCs移植后miR-141-3p水平明显下降,miR-200a-3p、miR-21和miR-153水平无明显变化,EPCs移植修复PQ-ALI与miR-141-3p相关。6.应用细胞转染的方法上调MLE-12细胞中miR-141-3p水平后Notch-1及其下游靶基因Hesr-1的mRNA及蛋白表达水平下降。7.PQ处理后,MLE-12细胞中Notch-Nrf2轴相关分子的表达水平下降,基因敲除miR-141-3p后可逆转PQ对Notch-Nrf2轴的抑制效应。8.PQ条件下,基因敲除miR-141-3p同时转染si-notch后,Nrf2及其下游分子表达受抑制。9.体内过表达miR-141-3p后,EPCs移植对PQ-ALI抗水肿、抗炎、抗氧化等的保护作用消失,同时Notch信号通路蛋白水平表达受抑制。结论:1.密度梯度离心联合贴壁培养法可以成功分离培养外周血内皮祖细胞。2.内皮祖细胞移植对百草枯诱导的急性肺损伤具有保护作用。3.内皮祖细胞移植通过减轻肺水肿、降低氧化应激反应以及调节炎症因子的表达等方面对PQ-ALI发挥保护作用。4.Notch-1及Nrf2通路在PQ-ALI中发挥重要作用,内皮祖细胞移植通过Notch-Nrf2轴治疗PQ-ALI。5.miR-141-3p与EPCs移植对PQ-ALI的保护作用相关。6.PQ通过上调miR-141-3p表达水平对Notch-Nrf2轴发挥抑制性调控作用。7.EPCs移植通过下调miR-141-3p的表达水平,从而促进Notch-Nrf2轴信号分子的表达发挥抗水肿、抗炎、抗氧化等保护作用。
【图文】：

因子表,表达水平,方法,肺组织

中国医科大学博士学位论文3.3 EPCs 归巢因子表达情况在正常对照组和 EPCs 对照组中，VEGF、CXCR4 和 SDF-1mRNA 均无明显变化，两组对比无差异（P>0.05）；PQ 条件下归巢因子 VEGFmRNA 明显增加，与对照组比差异显著（P<0.05），EPCs 移植后可使小鼠肺组织 VEGFmRNA 进一步增加，，与 PQ 损伤组对比差异显著（P<0.05）；EPCs 归巢因子 CXCR4 与 SDF-1mRNA 在PQ 损伤组显著降低，与对照组对比差异显著（P<0.05），EPCs 移植组 CXCR4 与SDF-1mRNA 明显升高，与 PQ 损伤组对比差异显著（P<0.05），可见，EPCs 移植后可明显归巢至受损肺组织发挥作用，如图 3.3。

肺组织,小鼠,显微镜下,HE染色

15组织病理学表现（A、小鼠肺组织 HE 染色后光学显微镜下表现；分情况**P<0.05vs Control；##P<0.05 vs PQ）织湿/干比（W/D） 3.4.2 所示：正常对照组与 EPCs 对照组相比小鼠肺 W/D 比差异（P>0.05）；PQ 损伤组小鼠肺组织 W/D 明显增加，与（P<0.05）；尾静脉移植 EPCs 后可以明显降低小鼠肺组织比差异显著（P<0.05），EPCs 移植后可逆转 PQ 所致肺组织 W
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R595.4

【参考文献】