过度自噬对急性肺损伤小鼠模型白介素—33表达和失控性炎症的调控作用及初步机制探讨

发布时间：2020-04-25 14:11

【摘要】：目的:研究过度自噬(Excessive autophagy)对白介素-33(Interleukin-33,IL-33)在急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)中促炎作用的调控作用。方法:1.收集正常健康对照者和临床ARDS患者的血浆标本,用ELISA的方法检测其中IL-33的表达量,用细胞因子磁珠分选法检测其中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-10表达量。2.将20只雄性C57BL/6 WT小鼠随机分成4组,分别是空白对照组(N组),脂多糖处理组(LPS组)、脂多糖+雷帕霉素预处理组(RAPA组)、脂多糖+3-甲基腺嘌呤预处理组(3-MA组),n=5/组。采用气管滴注LPS的方式来制备急性肺损伤模型。在LPS组小鼠气管滴注含LPS的PBS制备肺损伤模型。在手术前30分钟,按体重比例给予RAPA组小鼠腹腔注射雷帕霉素4mg/kg,按体重比例给予3-MA组小鼠腹腔注射3-甲基腺嘌呤15mg/kg。于术后24小时观察小鼠的一般情况;取小鼠血液、肺组织及肺泡灌洗液标本;HE染色并在显微镜下观察记录其形态学变化,评估小鼠肺组织的损伤程度;免疫组化与qRT-PCR检测小鼠肺组织中IL-33蛋白和mRNA的表达情况;免疫荧光及qRT-PCR检测小鼠肺组织中NF-κB的表达情况;western-blot检测小鼠肺组织中LC3和P62表达情况;ELISA方法检测小鼠血清与肺泡灌洗液中IL-33表达,细胞因子磁珠分选方法检测CXCL-1、TNF-α、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-4、IL-6和CXCL-5水平的变化。结果:1.人血浆IL-33水平及其与其它细胞因子相关性ARDS患者血浆IL-33水平高于健康对照组(P0.0001);相关性分析显示,ARDS患者血浆中IL-33与TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6呈正相关,与IL-10呈负相关。2.小鼠肺组织病理改变光镜下观察经HE染色的肺组织,LPS组、RAPA组和3-MA组小鼠肺组织均可见明显水肿、肺泡壁广泛增厚、肺泡塌陷、肺泡内出血和大量炎症细胞浸润。其中,3-MA组小鼠肺组织上述病理改变较LPS组明显减轻,RAPA组小鼠肺组织上述病理改变较LPS组加重,N组未见明显的肺损伤及炎症表现。3.小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-33水平变化与空白对照组相比,LPS组、RAPA组和3-MA组小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-33的水平均发生了不同程度的变化。与LPS组相比,在经过RAPA预处理后,小鼠血清及肺泡灌洗液当中IL-33的水平有所增加(P0.0001,P0.0001),经过3-MA预处理后,血清及肺泡灌洗液中IL-33水平稍增加,但低于LPS组水平(P0.05,P0.05)。4.小鼠肺组织中IL-33蛋白的表达与对照小鼠相比,LPS组、RAPA组及3-MA组小鼠肺组织中IL-33均有一定程度的增加。与LPS组相比,经过RAPA预处理之后的RAPA组小鼠肺组织中的IL-33蛋白水平增加,经过3-MA预处理之后的3-MA组小鼠肺组织中IL-33蛋白水平降低。5.小鼠肺组织中IL-33 mRNA的表达qRT-PCR数据显示,LPS组小鼠肺中IL-33 mRNA升高,3-MA组中mRNA的表达低于LPS组(P0.001)。RAPA组肺组织中IL-33mRNA,高于LPS组(P0.05)。6.小鼠血清和肺泡灌洗液中多种细胞因子水平的变化RAPA组小鼠血清以及肺泡灌洗液中CXCL-1、CXCL-5、TNF-α、IL-17A和IL-6的表达量增加,其表达量高于LPS组(p0.001,p0.05;p0.05,p0.05;p0.01,p0.05;p0.0001,p0.001;p0.05,p0.001)。3-MA组血清以及肺泡灌洗液中CXCL-1、CXCL-5、TNF-α、IL-17A、IL-6的表达量相对于LPS组有所下降(P0.0001,p0.01;p0.0001,p0.0001;p0.0001,p0.01;p0.001,p0.001;p0.05,p0.01)。RAPA组小鼠血清以及肺泡灌洗液中IL-10的表达量低于LPS组(P0.05,p0.0001),3-MA组小鼠血清以及肺泡灌洗液中IL-10的表达量高于LPS组(P0.01,p0.05)。LPS组、RAPA组、3-MA组小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4和IL-13表达量无明显统计学差异。7.小鼠肺组织LC3-Ⅱ和P62的表达量变化与正常对照组相比,LPS组小鼠肺组织中LC3B-Ⅱ的表达量增加,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值增加。RAPA组小鼠肺组织中LC3-Ⅱ的表达量高于LPS组,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值增加。3-MA组小鼠肺组织中LC3-Ⅱ的表达量低于LPS组,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值降低。RAPA组小鼠肺组织中P62的表达量低于LPS组,P62/actin比值降低,3-MA组小鼠肺组织中P62表达量高于LPS组,P62/actin比值升高。8.小鼠肺组织中NF-κB(P65)核转位变化气道滴注LPS之后小鼠肺组织NF-κB(P65)的核转位增加,LPS组的NF-κB(P65)的核转位高于正常组。与LPS组相比,RAPA组NF-κB(P65)的核转位水平增加。在3-MA组的NF-κB(P65)的核转位稍有增加,但与LPS组相比,其核转位水平较低。结论:过度自噬可影响小鼠急性肺损伤模型失控性炎症进程。过度加强的自噬能够加重小鼠肺部炎症,抑制自噬能减轻小鼠肺部炎症;过度自噬能调控小鼠急性肺损伤模型中IL-33的表达,其与NF-κB(P65)表达可能相关。
【图文】：

见图 1.1-C）、IL-2（r=0.7500，p<0.001，见图1.1-D）、IL-6（r=0.6373，p<0.01，见图 1.1-E）呈正相关，而与 IL-10（r=0.4975，p<0.05，见图 1.1-F）呈负相关。1.1-A 1.1-B1.1-C 1.1-D1.1-E 1.1-F图 1.1 患者血清 IL-33 表达及其与其他细胞因子相关性分析Fig 1.1 IL-33 and Correlation between serum IL-33 and other cytokine

图 2.2 小鼠肺组织 LC3 和 P62 蛋白表达Fig 2.2 protein of LC3 and p62 in mouse lung.3 肺组织 HE 染色取空白对照组小鼠以及实验组小鼠肺组织进行 HE 染色，观察小鼠肺组织理改变，结果显示：气道滴注 LPS 之后，小鼠肺组织出现明显病理学改肺泡充血，出血，肺泡间隔增厚，肺透明膜形成，并伴有大量炎症细胞浸对照组小鼠肺组织未见明显肺损伤及相关病理学改变，与 LPS 组相比，，R损伤评分明显增高，而 3-MA 组小鼠肺损伤评分下降。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563.8

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本文编号：2640330