自噬活性对巨噬细胞极化与糖尿病小鼠创面愈合的影响

发布时间：2020-05-07 00:21

【摘要】：目的:糖尿病是一种多病因引起的慢性代谢性疾病,其伴随的多系统损害极大困扰着人们,其中糖尿病难愈合创面发病机制极为复杂,其主要原因在于创面持续的慢性炎症状态,目前研究认为这种炎症状态与创面内不同极化状态的巨噬细胞的平衡有关,同时自噬在创面愈合中多个环节参与并发挥了重要作用,但两者在糖尿病创面愈合中的关系还尚未得到研究,本研究旨在通过运用自噬调节剂对糖尿病小鼠创面模型进行干预,探究自噬活动是否与糖尿病创面中巨噬细胞的极性状态相关,以及对创面愈合效率产生的影响。方法:96只SPF级雄性BALB/C小鼠,通过腹腔注射150mg/kg剂量的链脲佐菌素来建立糖尿病小鼠模型,成模后随机分为4组:高剂量雷帕霉素组(HR组)、低剂量雷帕霉素组(LR组)、3-Methyladenine抑制组(3-MA组)及空白对照组(Control组),每天腹腔注射对应药物,观察创面愈合情况,并分别于伤后1、3、5、7、10及14天取材,留取糖尿病小鼠创面新鲜皮肤组织液氮保存以及完整创面组织4%多聚甲醛固定石蜡包埋保存。后期通过研磨匀浆提取蛋白,用于检测创面皮肤组织中LC3、CD16及CD163蛋白表达情况,另一部分液氮储存的创面皮肤组织通过研磨匀浆提取RNA,采用qPCR技术检测创面组织中TNF-α与VEGF mRNA表达水平;石蜡切片通过免疫荧光染色技术检测CD16及CD163分别标记的创面组织中M1型与M2型巨噬细胞。结果:1.同对照组糖尿病小鼠创面对比,低剂量雷帕霉素组在创面愈合的整个过程中都呈现更高的创面愈合效率,高剂量雷帕霉素在创面愈合早期愈合速率高于对照组,逐渐降低,总体愈合效率低于对照组(P0.05);3-MA组早期愈合效率低于对照组,愈合中晚期愈合效率逐渐升高,总体愈合效率低于低剂量雷帕霉素组(P0.05);2.在糖尿病小鼠创面愈合整个过程中的各个时间点,应用雷帕霉素诱导自噬活性提高,M1型巨噬细胞相关蛋白CD16表达增加、M2型巨噬细胞相关蛋白CD163表达减少;应用3-MA抑制自噬活性,M2型巨噬细胞相关蛋白CD163表达增加,M1型巨噬细胞相关蛋白CD16表达减少(P0.05);3.免疫荧光染色技术检测结果显示,糖尿病小鼠创面愈合过程中各个时间点,HR组中M1型巨噬细胞标记CD16 阳性表达更高,M2型巨噬细胞标记CD163阳性表达较对照组低(P0.05);3-MA组中CD16阳性表达显著低于对照组及雷帕霉素诱导组,CD163 阳性表达显著高于其他组别(P0.05);4.对照组糖尿病小鼠创面愈合过程中,TNF-α mRNA表达的高峰在伤后第7天;同正常空白对照组糖尿病小鼠创面对比,雷帕霉素组小鼠创面中TNF-α mRNA表达高峰提前,炎症水平得到增强;3-MA组创面愈合过程中TNF-α mRNA表达水平受到抑制;雷帕霉素组小鼠创面中VEGF mRNA表达水平显著低于对照组,表明诱导自噬活性增强能够促使创面炎症水平升高(P0.05)。结论:雷帕霉素能够诱导链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的自噬活性升高,并促使创面中巨噬细胞向M1型极性状态转化,提高创面炎性水平;抑制自噬能够促使M2型巨噬细胞极性转化;低剂量雷帕霉素对糖尿病小鼠创面愈合具有促进的作用。
【图文】：

由此可以观察到，在糖尿病小鼠创面伤后第１天，使用雷帕霉素诱导自噻，自噬相逡逑关蛋白ＬＣ３表达增加，ＨＲ组Ｍｌ型巨噬细胞的极化状态较对照组更明显，而自噬活逡逑动受到抑制的３－ＭＡ组中Ｍ２型巨噬细胞的极化状态较诱导组及对照组高。见图２。逡逑ｓ逦—逦—邋ＬＵ邋0邋＇１邋Ｍ邋Ａ逦丁逡逑Ｉ邋…：叶，■：逡逑ｒｎｍｍｍ邋ｍｒｎｍ邋丨丨丨丨丨丨｜邋0．ｓ－邋Ｉ邋；；逡逑0．0Ｊ＾—ｒ—￣￣逦．逦逡逑１力１逦１＊５－逡逑ｇ0＇８＇邋Ａ邋＾逦｜ｌ．0．逦Ａ逡逑ｏ０＇４＇邋Ｈ邋ＩＩ邋Ｈ邋５0＊－逦＿逡逑０．０－１—－－ｒ－￣ｗｗｙｆｆｆｆ逦逦逦邋０．０逦ｉ邋■？＾Ｂ逦逦逦逡逑旁方＾逦＾逦＾邋＾邋／逡逑图２各组糖尿病小鼠创面皮肤组织在伤后第１天目的蛋白表达情况逡逑２．邋４．邋２．２将各组糖尿病小鼠在伤后第３天的创面边缘皮肤提取的蛋白进行逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ邋检测

显著性差异。由此可以发现，在糖尿病小鼠创面伤后第３天，ＬＲ组在低剂量诱导自逡逑噬的同时，Ｍｌ型巨噬细胞的极化状态较对照组更明显，而自噬活动受到抑制的３－ＭＡ逡逑组中Ｍ２型巨噬细胞的极化状态较诱导组及对照组高。见图３。逡逑…，邋ＣＤ１６邋２逦，ｒ＊￣邋．逡逑（ＨｈＨＩ邋ｆｌＨＮｉ逦ｃｔ＞ｉ６３邋５１＇°逡逑ａ邋0５邋Ｉ逡逑？ｐｄｈ邋０．０ＬＪｐ＿，＿＿Ｕ：＿，＿逡逑参邋／逦，》逦＾逦＾邋－ｆ邋／逡逑２．５－ｊ逦０．８－逡逑ｊｍ￡ｓＥｌ邋■尙逡逑图３各组糖尿病小鼠创面皮肤组织在伤后第３天目的蛋白表达情况逡逑２．邋４．２．３将各组糖尿病小鼠在伤后第５天的创面边缘皮肤提取的蛋白进行逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ检测，自嗤相关蛋白ＬＣ３－ＩＩ／ＬＣ３－Ｉ比值：ＨＲ组〉ＬＲ组及Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑组＞３－ＭＡ组；巨噬细胞Ｍｌ型相关蛋白ＣＤ１６／ＧＡＰＤＨ比值：ＬＲ组＞３ＭＡ组〉ＨＲ组〉Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑２８逡逑
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R641

【共引文献】

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本文编号：2652103