儿茶酚交联抗菌肽的水凝胶用于预防烧伤创面多重耐药菌的感染以及加快伤口愈合的研究

发布时间：2020-05-14 17:12

【摘要】：第一部分:儿茶酚交联抗菌肽水凝胶预防烧伤创面多重耐药鲍曼不动杆菌感染背景:医院获得性感染在烧伤患者中很常见,是造成烧伤患者病情加重甚至死亡的主要原因。鲍曼不动杆菌(A.baumannii)等细菌导致的创面感染很难治疗,因为它们可以通过形成生物被膜等方式从而产生对抗生素的耐药。故而我们应当开发出一种新的材料用于治疗烧伤创面的鲍曼不动杆菌的感染。水凝胶敷料被认为是伤口治疗和护理的重要手段,目前已经广泛运用于临床研究。水凝胶可以保持伤口表面的水分,对伤口的保湿至关重要。抗菌肽(AMPs)由于其利用物理的静电相互作用通过破坏细菌细胞膜而杀菌,不会使细菌产生耐药性以及其自身的安全性得到了广泛关注。ε多聚赖氨酸(EPL)是一种常见的AMPs,以其对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、酵母和霉菌的广谱抗菌性能而闻名。而且EPL是一种水溶性可生物降解的物质,化学性质稳定的且毒性较低。儿茶酚是一种无色的天然有机化合物(C6H4(OH)2)。研究人员利用贻贝仿生原理将分子量小,水溶性好的儿茶酚与EPL交联制备出抗菌水凝胶。该水凝胶可以用于烧伤创面的治疗而且可以有效防止创面感染,在烧伤创面治疗领域具有一定潜力。方法:水凝胶配方是EPL和儿茶酚,以贻贝作为交联剂。通过将不同比例的EPL和邻苯二酚,即凝胶1:(0.3:0.1)、凝胶2:(0.4:0.1)和凝胶3:(0.5:0.1)mol/L混合,制备成一系列EPL邻苯二酚水凝胶。采用临床多药耐药鲍曼氏菌(MRAB)为研究对象来研究水凝胶的体内外抗菌和抗生物活性。用克隆小鼠成肌细胞系(C2C12)评价EPL儿茶酚水凝胶的生物相容性。此外,我们在小鼠背部皮肤表面造成二度烧伤创面,并用MRAB涂抹伤口形成感染性创面。为了评价水凝胶的体内抗菌活性,对感染了第1天和第2天的创面上每克组织进行了细菌的计数。采用扫描电镜观察水凝胶对鲍曼氏菌的体内外抗菌作用。同时,将EPL儿茶酚水凝胶覆盖到小鼠创面,观察它通过抑制细菌感染来促进伤口愈合的作用,并研究相关机制。结果:通过对水凝胶的扫描电镜观察,发现了 EPL邻苯二酚水凝胶的高度交联的多孔结构。不同比例的水凝胶中,随着EPL浓度的增加,孔径减小。水凝胶的含水量从87%到94%不等。体外研究表明:EPL儿茶酚水凝胶对MRAB有很好的抗菌活性。随着EPL浓度的增加,EPL儿茶酚水凝胶对鲍曼不动杆菌的抑制也会增强。在EPL儿茶酚水凝胶与鲍曼不动杆菌过夜培养之后发现该水凝胶对MRAB具有100%的杀伤力。扫描电镜分析表明:经EPL-邻苯二酚水凝胶处理后,MRAB的表面形态发生了明显的破坏,产生了萎缩和起皱等结构变化。更为重要的是EPL儿茶酚水凝胶可以抑制MRAB生物膜的形成。抗生物膜试验表明:与TCPS(对照组)相比,EPL-邻苯二酚水凝胶处理之后只观察到少量活/死的MRAB细胞,而对照组中大多数细菌是活的(染成绿色),并且形成了生物被膜的结构。此外,EPL儿茶酚水凝胶对克隆小鼠成肌细胞系(C2C12)具有良好的体外生物相容性。在EPL-邻苯二酚水凝胶中,细胞呈周期性生长。烧伤创面接种MRAB,覆盖了水凝胶后,创面的细菌数量log10值较对照组降低了4.76。使用水凝胶48小时后,与对照组相比,观察到稍微上升到至5.70,但和对照组相比,仍然没有发生感染迹象。扫描电镜观察显示,与对照组相比,EPL儿茶酚水凝胶治疗的MRAB感染烧伤创面上细菌生长较少,而对照组MRAB大量增殖。在组织学研究中,与未经治疗的对照组相比,在小鼠局部应用EPL儿茶酚水凝胶的第1天和第2天未发现炎症细胞浸润、水肿或充血。此外与未经治疗的对照组相比,第2天和第5天小鼠皮下植入水凝胶后,显示表皮、真皮和皮下组织结构正常,无炎症迹象。这些结果表明,EPL儿茶酚水凝胶具有良好的生物相容性。结论:本研究首次建立了一种EPL与邻苯二酚交联的多孔水凝胶。通过这项研究,我们证明了这种水凝胶不仅具有体外抗菌作用,而且能够抑制MRAB生物膜活性。同时EPL儿茶酚水凝胶对哺乳动物细胞具有良好生物相容性且无细胞毒性。体外和体内研究均表明处理后实验组细菌数量显著减少。使用水凝胶后对小鼠皮肤的组织学检查没有任何炎症和组织改变的迹象。基于这些结果,我们得出结论,EPL儿茶酚水凝胶是一种具有优良的体外抗鲍曼不动杆菌效果以及具有体内生物相容性的新型材料。有望将来能够应用于临床的烧伤创面感染治疗。第二部分:基于贻贝仿生的接触抗菌水凝胶的设计以及体内促伤口愈合的研究背景:开放性伤口(如烧伤和创伤)总是受到各种病菌的感染。一旦遭受了细菌的感染就会延缓伤口的愈合,所以迫切需要开发一种新型的创面敷料,既能防止细菌的感染,又能促进伤口愈合。我们受海洋贻贝足丝的启发,开发了一种新型的抗菌水凝胶用于开放性伤口治疗。抗菌肽(AMP)通过物理静电相互作用而破坏了微生物的细胞膜,被认为不会对细菌产生耐药性。ε多聚赖氨酸(EPL)是蛋白链霉菌产生的一种天然抗菌肽,具有很强的广谱抗菌性能。与其他AMP不同的是,发酵生产EPL的成本相对较低。基于EPL的衍生物已被用于制备具有体外抗菌活性的水凝胶。然而这些水凝胶的制备通常涉及多个化学合成步骤,如EPL分子的修饰。贻贝仿生化学发生在温和的环境中,是一种简便制备材料的方法。最近的研究报告了邻苯二酚和多胺之间的反应。儿茶酚的酚基与胺反应生成了贻贝足丝蛋白样的薄膜。含25-30赖氨酸的EPL是一种典型的多胺类化合物,具有丰富的侧胺基团,可以与EPL儿茶酚反应生成交联网络。这项工作提出了一种新开发的儿茶酚和EPL水凝胶,具有治疗MRSA感染和加速伤口愈合的功能。方法:合成了三种EPL儿茶酚水凝胶。EPL(10、20和30 mmol/L)和邻苯二酚(30 mmol/L),即凝胶 1:(10:30)、凝胶 2:(20:30)和凝胶 3:(30:30)mmol/L混合。用扫描电镜观察了水凝胶的微观结构。测定了水凝胶对大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性。并且利用扫描电镜观察细菌形态。还利用活/死细菌染色观察EPL儿茶酚水凝胶的抗生物被膜的能力。采用C2C12细胞系测定EPL儿茶酚水凝胶的体外生物相容性。基于以上体外的研究,我们开展了水凝胶在体内的研究,我们建立了感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的小鼠烧伤创面,观察EPL儿茶酚水凝胶的体内抗感染效果。采用苏木精和伊红(HE)染色、IL-6和TNF-α的免疫组化染色和血管内皮生长因子(VEGF)的免疫荧光标记分析EPL儿茶酚水凝胶的抗炎效果和促伤口愈合特性。结果:以邻苯二酚为交联剂,合成了 EPL儿茶酚水凝胶。EPL儿茶酚水凝胶呈褐色,邻苯二酚氧化为醌。EPL儿茶酚水凝胶在水中迅速膨胀。水凝胶EPL儿茶酚中随着EPL含量升高,溶胀率也增加。通过SEM的图像显示水凝胶出现了多孔结构。EPL儿茶酚水凝胶对大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均具有抗菌活性。EPL儿茶酚(凝胶1)减少了 79.2%的大肠杆菌和59.4%的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。EPL儿茶酚(凝胶2)水凝胶对大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀灭率分别增加了 99.8%和97.5%。EPL儿茶酚(凝胶3)水凝胶对大肠杆菌和MRSA的抗菌效果最强,99.999%和99.9%杀死的杀灭率。我们利用共聚焦显微镜能够在石英片上观察到生物膜的形成(对照组)。然而,利用EPL儿茶酚(凝胶3)水凝胶处理的对照组则没有生物被膜的形成,说明水凝胶可以抑制了生物膜的形成。EPL儿茶酚水凝胶在第1天和第3天的体外细胞毒性与对照组(TCPS)相比生长速度稳定,表明EPL儿茶酚水凝胶无细胞毒性。与TCPS对照组相比,EPL儿茶酚水凝胶能增加小鼠微血管内皮细胞的迁移,说明EPL儿茶酚水凝胶有助于新生血管的形成。在体内抗菌研究中,我们观察了 EPL儿茶酚水凝胶在MRSA感染烧伤创面上的治疗3天,与对照组相比显著降低了 99.9%和99.8%(P0.01)。苏木精和伊红(HE)染色显示对照组(生理盐水组)和聚乙二醇(PEGDA)水凝胶组在第1天和第3天有大量炎性细胞(蓝色)浸润。另一方面,EPL儿茶酚水凝胶降低了 MRSA感染烧伤部位的炎症效应。此外,通过扫描电镜观察显示:EPL儿茶酚水凝胶降低了烧伤创面MRSA的感染。与对照组(生理盐水组)和PEGDA相比,EPL儿茶酚水凝胶具有显著的伤口修复和皮肤再生性能。EPL儿茶酚水凝胶治疗10天创面与生理盐水组和PEGDA水凝胶组相比几乎完全闭合。第3天的组织学分析显示用EPL儿茶酚水凝胶治疗的伤口炎症细胞减少。第6天,EPL儿茶酚水凝胶治疗组出现毛囊和血管,而生理盐水和PEGDA治疗组未见毛囊和上皮。第10天,EPL儿茶酚水凝胶治疗组与生理盐水组相比,出现大量毛囊、血管和完全表皮,PEGDA组出现轻度急性炎症反应。这些结果表明EPL儿茶酚水凝胶可以促进伤口愈合。此外,免疫组化染色显示EPL儿茶酚水凝胶促炎细胞因子的表达较少,表明其具有抗炎活性,有助于伤口愈合。与其他两个对照组(生理盐水组和PEGDA组)相比,EPL儿茶酚水凝胶在第3天、第6天和第10天显示高血管内皮生长因子(VEGF)表达。结论:在这项研究中,我们设计了一种基于贻贝仿生的抗菌水凝胶。在室温下采用一步法直接将EPL与邻苯二酚交联。EPL儿茶酚水凝胶具有明显的接触抗菌作用。体外实验表明,EPL儿茶酚水凝胶不仅对大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有显著的杀菌作用,而且具有防止细菌生物膜形成的功能。此外,EPL儿茶酚水凝胶与小鼠成肌细胞(C2C12)具有良好的生物相容性,促进了小鼠血管内皮细胞的体外迁移。更重要的是,在烧伤创面感染和全层皮肤创面动物模型显示,EPL儿茶酚水凝胶不仅能抑制烧伤创面MRSA感染,而且通过减少促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的表达,增加血管内皮生长因子(VEGF)的表达来促进创面愈合。这些结果表明,EPL儿茶酚水凝胶是一种很有前途的用于伤口敷料的材料,可以预防伤口感染,加速伤口愈合。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R644

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