【摘要】：研究背景:急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory dirstress syndrome,ARDS)是临床表现为双肺弥漫性浸润、进行性下降的顽固性低氧血症的临床综合征,其肺部病理表现为肺组织被大量炎症细胞浸润、肺泡塌陷、肺间隔增宽及肺泡内透明膜形成。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)以往被认为是ARDS的特定表现,在2012年柏林标准中将其归入ARDS中。但是在动物模型中模拟的ARDS过程,仍被被称为ALI。脓毒症是ARDS的最常见病因,其发生与细菌细胞壁脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)密切相关,因而LPS常用于诱导ARDS的动物模型。ARDS属临床急危重症,其年发病率为75/100,000人次,病死率波动在35%至46%之间。尽管历经半个世纪的研究,ARDS的发病机制仍不甚明了,人们尝试了多种药物及辅助治疗手段治疗ARDS,其中被证明有效的治疗手段寥寥无几,而药物治疗和分子治疗无一能改善ARDS的死亡率。ARDS的主要治疗方法仍为机械通气呼吸支持治疗。临床的现实迫使我们对ARDS的发病机制及病理生理过程进入深入细致的研究,从中发掘潜在治疗靶点及新的治疗方法,以期攻克疾病。本质上,ARDS的发病机制是机体在遭受重大致病因素打击后,剧烈炎症级联反应导致的广泛肺损伤。因此ARDS后的炎症修复与患者预后密切相关。Treg细胞被证实能够促进ARDS炎症的修复,在炎症修复期有着重要的功能,肺内Treg细胞数量与增殖速度直接影响患者预后。同时,Nogo-B,网状蛋白4的剪接体,广泛表达于肺组织,已被证实在多种组织损伤后,如肝硬化、爆发性肝炎等的组织修复、炎症控制等方面有着重要功能,并参与调控细胞增殖。但是,Nogo-B在ARDS炎症后组织修复的作用,以及Nogo-B与Treg细胞间的作用关系尚无研究。本研究将探究LPS诱导的ALI小鼠模型炎症修复过程中,Nogo-B扮演着什么角色,是否并且如何参与到炎症修复过程。据我们所知,该内容尚无人报道。目的:明确Nogo-B在ALI小鼠模型炎症修复期的作用,明确Nogo-B在Treg细胞急性肺损伤保护过程中的地位,以期能寻找ARDS炎症修复期的关键蛋白靶点,为A RDS的救治寻找新的思路。方法:本研究通过LPS气管滴注的方法构建ALI小鼠模型,采用迪夫快速染色法对BA L细胞BAL进行分类计数,HE染色观察肺部病理变化,获得ALI小鼠模型从发病第1天至第10天的病理生理发展特点与自然病程。通过流式细胞术检测BAL中Treg的数量,明确ALI小鼠模型中BAL Treg细胞数量与炎症修复各阶段间的关系。同时,我们应用实时定量PCR技术检测急性炎症期和炎症修复期ALI小鼠肺组织及BAL细胞N ogo-B的表达水平,并通过免疫荧光证实Nogo-B在Treg细胞中的表达,以期证实Nog o-B在ALI小鼠模型炎症修复期中表达及Treg细胞中的表达变化。其次,我们采用CRISPR/Cas9技术构建Nogo-B基因敲除小鼠。分别使用Nogo-B基因敲除小鼠和野生型小鼠复制ALI模型,描绘两组ALI模型小鼠的体重变化。采用迪夫染色对BAL细胞进行分类计数、HE染色观察肺部病理组织改变,以观察两组A LI小鼠的炎症修复期肺部损伤修复进程的差异,进一步明确Noog-B对ALI炎症修复的影响。通过流式细胞术检测两组ALI小鼠BAL中Treg细胞数量变化情况,采用ELI SA检测两组ALI小鼠BAL及血清中IL-10、TGFβ及IL-2水平的变化情况。以期观察两组小鼠ALI炎症修复期Treg细胞及抗炎因子。再次,我们采用腺病毒在体转染的方法,给与Nogo-B敲除小鼠和野生型小鼠肺部过表达Nogo-B,并通过实时定量PCR及免疫荧光的方法验证在体转染的效果。复制ALI小鼠模型,通过细胞分类计数方法计算不同Nogo-B表达小鼠ALI模型中炎症修复期中性粒细胞数量,通过肺组织HE染色观察不同Nogo-B表达小鼠肺部病理损伤程度,以期明确Nogo-B过表达对ALI小鼠模型的炎症修复进程的影响。使用流式细胞术检测不同Nogo-B表达小鼠BAL中Treg细胞数量,以期明确Nogo-B对ALI炎症修复期肺部Treg细胞数量的作用。而后,为明确Nogo-B在Treg对急性肺损伤的保护作用中的地位,我们使用过继回输方法,给Rag-/-小鼠ALI模型分别静脉回输Nogo-/-Treg细胞及WT Treg细胞,观察各组ALI小鼠肺部病理损伤程度,BAL中性粒细胞数量,使用BCA蛋白定量测量各组ALI小鼠BAL中蛋白含量。为明确不同Nogo-B表达的Treg细胞肺部募集水平的差异,我们使用流式细胞术检测以上各组ALI小鼠BAL中Treg细胞的数量。最后,为明确Nogo-B影响ALI小鼠模型肺部Treg细胞募集的作用机制,我们使用磁珠分选技术纯化提取Nogo-B敲除的Treg细胞及野生Treg细胞,利用迁移实验、增殖实验验证Nogo-B对Treg细胞迁移、增殖功能的影响。并采用TGF-β刺激分化No go-B敲除及野生初始型T细胞为Treg细胞,观察Nogo-B对初始型T细胞分化的影响。采用ELISA方法,检测激活的Nogo-B敲除Treg细胞及野生Treg细胞分泌IL-10的能力,以明确Nogo-B对Treg细胞分泌IL-10的影响。结果:一、ALI小鼠模型炎症修复期的特点和Nogo-B的表达变化根据ALI小鼠模型BAL细胞学分类和肺组织病理变化,我们明确在LPS诱导后第4至7天机体处于炎症修复期,第7天后为纤维化形成期。Treg细胞在第4天数量显著升高,到第7天达到高峰,明确Treg参与了炎症修复过。实时荧光定量PCR结果和免疫荧光结果显示ALI小鼠肺组织和肺泡灌洗液细胞中Nogo-B的表达在炎症修复期显著升高,其变化趋势与Treg数量变化趋势一致。Treg细胞免疫荧光证实其表达Nog o-B蛋白。二、敲除Nogo-B基因后急性肺损伤炎症修复受损我们采用CRISPR/Cas9技术构建C57BL/6背景Nogo-B-/-小鼠,并成功验证Nogo-B-/-小鼠Nogo-B基因和蛋白表达缺失,提示Nogo-B敲除小鼠构建成功。ALI小鼠体重显示,Nogo-B-/-小鼠与WT小鼠在LPS诱导后第3天,体重处于最低谷,第4天体重开始恢复,第7天WT小鼠体重恢复至原水平而Nogo-B-/-小鼠仍处于第4天水平。与WT小鼠相比,Nogo-B-/-小鼠ALI模型炎症修复期BAL总细胞数和中性粒细胞数较高,肺部病理损伤较重,表明Nogo-B敲除后,ALI小鼠炎症修复能力较差。Nogo-B-/-ALI小鼠炎症修复期肺部Treg细胞数量较WT ALI小鼠低,BAL及血清中IL-10水平、IL-2水平较WT ALI小鼠低。表明Nogo-B敲除后,Treg细胞的肺部募集能力较差,肺部抗炎因子及Treg细胞增殖相关因子水平下降。三、过表达Nogo-B促进急性肺损伤的炎症修复我们采用重组腺病毒气道滴注的方式过表达Nogo-B,并使用实时定量PCR验证该方法能够在小鼠肺部过成功表达Nogo-B。Nogo-B过表达的ALI小鼠的炎症修复期肺部病理损伤较对照组低,BAL中性粒细胞数较对照组低,表明Nogo-B过表达能够恢复Nogo-B-/-敲除小鼠ALI模型炎症的修复,促进ALI小鼠肺部炎症修复。Nogo-B过表达小鼠ALI模型肺部Treg数量较对照组高,证明过表达Nogo-B能够促进Treg细胞的肺部募集。四、Nogo-B在Treg细胞对ALI肺保护作用中的地位相比于WT Treg细胞,过继回输Nogo-B-/-Treg细胞无法修复Rag-/-小鼠ALI模型炎症修复期肺部病理损伤,无法降低Rag-/-小鼠ALI模型炎症修复期BAL中性粒细胞数量,无法降低Rag-/-小鼠ALI模型炎症修复期BAL蛋白总量,提示Nogo-/-Treg细胞对ALI炎症修复能力受损,反证Nogo-B在Treg细胞对ALI肺部的促进作用。相比于WT Treg细胞,过继回输Nogo-B-/-Treg细胞的Rag-/-小鼠ALI模型炎症修复期Treg细胞数量下降,表明Nogo-B敲除的Treg细胞肺部募集能力受损。五、Nogo-B促进Treg细胞的增殖及分泌IL-10的能力采用磁珠分选技术,成功提取纯度为95%作用的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞。对比LPS刺激后WT Treg细胞与Nogo-B-/-Treg细胞迁移能力,结果显示两组细胞迁移能力无差异;对比TGF-β刺激下WT初始型T细胞与Nogo-B-/-初始型细胞分化为Treg细胞的能力,结果显示两组细胞分化能力无差异;对比CD3、CD28及IL-2刺激下WT Treg细胞与Nogo-B-/-Treg细胞增殖能力,结果显示无论细胞浓度为多少,W T Treg细胞增殖能力强于Nogo-/-Treg细胞。对比CD3、CD28及IL-2刺激下WT Treg细胞与Nogo-B-/-Treg细胞分泌IL-10的能力,结果显示WT Treg细胞分泌IL-10的强于Nogo-/-Treg细胞。结论:一、LPS气管内滴注诱导的ALI小鼠模型炎症修复期位于LPS诱导后第4天至第7天,该期间肺部Treg细胞数量显著升高,Nogo-B的表达在炎症修复期升高,其在炎症修复期间的变化趋势与Treg细胞变化趋势一致。表明Nogo-B可能参与了 ALI模型的炎症修复过程,且可能与Treg细胞相关。二、敲除Nogo-B基因使ALI小鼠肺部炎症损伤加重,炎症修复能力下降,肺部Treg细胞数量减少,证实Nogo-B参与ALI炎症修复期的修复过程和Treg细胞的肺部募集。三、过表达Nogo-B可以使ALI小鼠肺部病理损伤得到修复,减少肺部炎症细胞数量,增加肺部Treg数量,证实Nogo-B促进ALI小鼠的炎症修复,促进Treg细胞的肺部募集。四、过继回输Noog-B基因敲除的Treg细胞无法修复Rag-/-小鼠ALI的炎症损伤,无法使Treg细胞募集至肺部,证明Nogo-B对Treg细胞的肺部保护作用有着重要作用。五、Nogo-B基因敲除的Treg细胞增殖能力及分泌IL-10的能力下降。
【图文】：
逦４邋＾邋Ｊ邋，逦？邋？邋＃逡逑图１－２．ＡＬＩ模型不同时间点ＢＡＬ细胞涂片（八）气＿滴注ＰＢＳ后小鼠ＢＡＬ细胞涂片（Ｉ００0ｘ）；逡逑（Ｂ）气管滴注ＬＰＳ邋１天后小鼠ＢＡＬ细胞涂片（１０００ｘ）；邋（Ｃ）气管滴注ＬＰＳ邋４天后小鼠ＢＡＬ细胞逡逑涂片（１００0ｘ）；邋（Ｄ）气管滴注ＬＰＳ邋７天后小鼠ＢＡＬ细胞涂片（ｌＯＯＯｘ）：邋（Ｅ）气管滴注ＬＰＳ邋１０天后小逡逑鼠ＢＡＬ细胞涂片（１０００ｘ）逡逑－２５邋－逡逑
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【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563.8
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