【摘要】：研究背景:在急性高原缺氧、严重烧伤、创伤休克等条件下,心肌细胞均可能因缺氧损伤而导致自噬体(Autophagosome)累积,放大心肌损害,外部环境改变导致的心肌急性缺氧损伤是自噬流(Autophagy flux)阻断的中心环节。自噬(Autophagy)是维持细胞在生理及病理状况下代谢平衡的重要过程。在自噬进程中,溶酶体(Lysosome)需要维持酸性的腔内环境(p H 4.5-5.0)以保证腔内酸性水解酶的正常功能,溶酶体酸化对于自噬底物降解、维持自噬流通畅至关重要。然而,当机体遭遇各种环境使心肌细胞遭受急性缺氧损伤,溶酶体酸化出现障碍,腔内酸化水平减弱,阻碍了心肌自噬过程,导致自噬体得不到降解而逐步累积,溶酶体酸化障碍成为自噬流阻断的重要原因。因此,研究溶酶体酸化机理,探究溶酶体酸化的调控因素,将为改善缺氧心肌的溶酶体酸化提供治疗依据。人抗原R(Hu-Antigen R,HuR)是目前研究较为深入且广泛的一种RNA结合蛋白,当细胞处于正常状态下,HuR主要定位于细胞核,处于“非活化”状态,当细胞遭遇某些病理环境,HuR将在细胞核内结合多种m RNA并将m RNA“护送”至细胞质,这一过程中维持着所结合m RNA的稳定同时促进m RNA翻译过程,在既往研究中,多以HuR在细胞质中的富集作为其功能活化的判定标准。我们前期研究发现,多种细胞自噬激活状态下,都伴随着HuR由胞核富集到胞质,提示HuR可能参与了细胞自噬过程。已有研究显示,HuR能够结合并维持溶酶体液泡型腺苷三磷酸酶(vacuolar H+ATPase,v-ATPase)部分亚基的m RNA的稳定性,参与v-ATPase的分子水平调控。v-ATPase通过水解ATP产生的能量驱动胞质H+进入溶酶体,是溶酶体实现酸化并发挥降解功能的关键分子。然而,HuR与溶酶体酸化的相关性鲜有报道,我们猜测,在心肌细胞自噬过程中,HuR参与维持溶酶体酸化。当机体遭遇严重烧伤等状况下,HuR的改变未见报道,我们猜测,HuR的功能障碍参与了烫伤后心肌自噬流损伤。本研究中,我们构建了小鼠背部30%TBSA三度烫伤模型,以及体外构建心肌细胞缺氧模型以模拟烫伤后心肌缺氧环境,研究烫伤后心肌自噬、溶酶体酸化改变以及HuR蛋白变化。并通过外源性调控HuR,探究其在心肌细胞自噬过程中对于溶酶体酸化的作用,为改善烫伤等病理环境下,心肌急性缺氧导致的溶酶体酸化障碍以及自噬流损伤提供基本理论依据。研究方法:1.以成年C57BL/6小鼠为研究对象,建立背部约30%TBSA三度烫伤模型,通过WB实验检测小鼠心肌自噬指标及HuR核浆分布情况。2.以原代培养C57BL/6小鼠乳鼠心肌细胞为研究对象,通过无糖培养基及缺氧环境构建心肌细胞急性缺氧模型。通过WB实验检测心肌细胞自噬水平变化,检测全细胞总蛋白、胞质蛋白、胞核蛋白中HuR蛋白变化情况,同时通过免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF),检测HuR的蛋白分布水平变化及溶酶体酸化改变。3.利用HuR-小干扰RNA(HuR-si RNA,200n M)及HuR核浆转运激活剂Cyclosporin A(Cs A,5.0?g/m L)处理细胞,下调或激活心肌细胞HuR并检测溶酶体酸化水平及自噬水平改变,同时观察心肌细胞的损伤及活力变化情况,明确HuR对心肌细胞溶酶体酸化的调控作用。4.使用HuR-si RNA和激活剂调控HuR,通过RT-q PCR及WB检测无糖处理后ATP6V1E1的核酸及蛋白表达,明确HuR调控溶酶体酸化的作用环节。结果:1.小鼠30%TBSA三度烫伤后,心肌组织Hif-1?表达增加,提示缺氧损伤加重。自噬标志物ATG5表达明显升高,自噬水平显著升高,LC3、p62表达升高,提示自噬体累积,自噬流损伤加重,同时HuR核浆转运未激活。进一步构建心肌细胞缺氧模型,检测自噬相关指标,发现ATG5表达明显升高,自噬水平显著升高,LC3、p62表达升高,提示自噬体累积,自噬流损伤加重。同时,心肌细胞缺氧模型中,HuR核浆转运受限,溶酶体酸化障碍。2.在缺氧环境中,利用激活剂Cyclosporin A(Cs A)上调HuR核浆转运水平,检测溶酶体酸化水平及溶酶体内组织蛋白酶D的蛋白水平,结果表明溶酶体酸化得到改善,溶酶体内组织蛋白酶含量增加,提示HuR对溶酶体酸化的调控作用。同时HuR激活后,心肌细胞活力有所增加,提示HuR对于维持缺氧心肌细胞功能发挥积极作用,激活剂Cyclosporin A能够改善缺氧心肌细胞自噬及溶酶体酸化。3.利用无糖培养基建立HuR激活及溶酶体酸化阳性对照模型,检测发现单纯无糖环境能够激活心肌细胞HuR核浆转运及溶酶体酸化,通过HuR-si RNA干扰HuR表达,检测溶酶体酸化水平及溶酶体内组织蛋白酶D的蛋白水平,结果表明溶酶体酸化显著受到限制,溶酶体内组织蛋白酶含量下降,进一步证明HuR对溶酶体酸化的调控作用。同时HuR表达下调后,心肌细胞活力下降,提示HuR对于维持心肌细胞功能发挥积极作用。4.在缺氧环境下,利用激活剂上调HuR核浆转运后,检测v-ATPase亚基ATP6V1E1的核酸及蛋白水平,结果发现ATP6V1E1的核酸及蛋白水平升高;单纯无糖环境中,下调HuR,重复上述检测,结果提示ATP6V1E1的核酸及蛋白水平均显著下降。提示HuR参与调控溶酶体上v-ATPase的分子稳定。结论:缺氧心肌细胞自噬水平显著升高,而HuR核浆转运受限,溶酶体酸化障碍,导致自噬底物降解受阻,自噬流阻断,造成心肌损害。利用激活剂上调HuR核浆转运,能够显著改善溶酶体酸化水平。HuR能稳定溶酶体上H+转运体v-ATPase亚基ATP6V1E1m RNA的分子稳定,从而维持ATP6V1E1的蛋白水平。以上结果提示HuR参与维持溶酶体酸化,而维持v-ATPase在细胞自噬激活后的持续表达是维持溶酶体酸化的重要调控机制,该结论进一步丰富了心肌自噬及溶酶体酸化的理论认识,通过调控HuR改善缺氧心肌溶酶体酸化,可能成为治疗缺氧心肌自噬流损伤新的靶点。
【图文】：
图 2-1 小鼠背部 30%TBSA 三度烫伤/心肌细胞缺氧损伤对心肌自噬的影响2.2.2 小鼠背部 30%TBSA 三度烫伤后心肌组织及缺氧心肌细胞，，HuR 核浆转运未激活根据 WB 结果显示（图 2-2），与对照组相比，烫伤不同时间点总蛋白中 HuR 表达差异无统计学意义（图 2-2，A，B）（n=3，P>0.05 vs.sham）；烫伤 6h、12h、24h后心肌组织胞质蛋白中 HuR 表达降低（n=3，*P<0.05 或**P<0.01 vs.sham）；烫伤 12h、24h 后心肌组织胞核蛋白中 HuR 表达升高（图 2-2，A，C，D）（n=3，*P<0.05 或**P<0.01vs.sham ） 。
图 2-1 小鼠背部 30%TBSA 三度烫伤/心肌细胞缺氧损伤对心肌自噬的影响2.2.2 小鼠背部 30%TBSA 三度烫伤后心肌组织及缺氧心肌细胞，HuR 核浆转运未激活根据 WB 结果显示（图 2-2），与对照组相比，烫伤不同时间点总蛋白中 HuR 表达差异无统计学意义（图 2-2，A，B）（n=3，P>0.05 vs.sham）；烫伤 6h、12h、24h后心肌组织胞质蛋白中 HuR 表达降低（n=3，*P<0.05 或**P<0.01 vs.sham）；烫伤 12h、24h 后心肌组织胞核蛋白中 HuR 表达升高（图 2-2，A，C，D）（n=3，*P<0.05 或**P<0.01vs.sham ） 。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R644
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本文编号：
2670618
