Btk抑制剂对小鼠急性肝衰竭的保护作用及机制探讨

发布时间：2020-06-16 11:38

【摘要】：研究背景与目的肝衰竭是一种因短期内肝细胞大量坏死而出现严重肝脏功能障碍的临床综合征,严重危害人类健康。临床上尚缺乏对肝衰竭有效的药物治疗手段。近年来,免疫介导的肝损伤成为肝衰竭的研究热点之一,固有免疫和适应性免疫共同参与了肝衰竭的发生发展过程。布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,Btk)属于Tec家族的一员,主要表达于除T淋巴细胞和浆细胞以外的免疫细胞中。大量研究显示,Btk在调节机体免疫应答、调控炎症因子表达中具有重要作用。本研究将利用两种不同的小鼠急性肝衰竭模型验证Btk抑制剂可能的保护效应,并探讨其中的作用机制。旨在明确Btk抑制剂对小鼠急性肝衰竭的保护作用,验证Btk作为急性肝衰竭治疗靶点的可能性和有效性,为临床肝衰竭的诊治提供新的方法与手段。研究方法第一部分:在两种不同的Btk抑制剂(依鲁替尼与艾拉替尼)处理后,分别利用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)联合 D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)、刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)建立两种不同的小鼠急性肝衰竭模型,收集血清测定谷氨酸丙酮酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST),通过苏木素-伊红染色评价肝脏病理变化;分别利用荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)分析小鼠肝脏、RAW264.7 细胞系、人原代 CD14+单核细胞中Btk抑制剂对炎症刺激下细胞因子的影响。第二部分:利用Romas细胞系、THP-1细胞系、L02细胞系检测Btk在肝细胞内的表达,并通过人肝组织的免疫组织化学分析结果确定Btk在肝脏中的表达情况;利用Western Blot技术和流式细胞技术明确p-Btk在炎症刺激下的表达变化;利用荧光定量PCR技术验证RAW264.7细胞在LPS刺激下多种细胞因子的表达变化;利用 Western Blot 技术分析 NOD 样受体蛋白 3(NOD-Like Receptor Protein 3,NLRP3)、核因子κB(Nuclear Factor-KB,NF-KB)表达变化,并利用荧光定量PCR技术分析mRNA水平变化;通过流式细胞技术分析小鼠肝脏T淋巴细胞亚群上CD69的表达,B淋巴细胞和树突状细胞(Dendritic Cell,DC)上CD80、CD86的表达。研究结果第一部分:Btk抑制剂可降低LPS/D-GalN和ConA模型下ALT、AST的上升,并改善小鼠肝脏坏死和炎症浸润情况;Btk抑制剂对TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10有良好的抑制作用。第二部分:Btk不表达于肝细胞;炎症刺激会引起Btk磷酸化水平的剧烈变化;除了 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10 以外,Btk 抑制剂对 LPS 刺激下 IL-2、IL-4、IFN-γ等因子的表达也有良好的抑制作用;体内及体外实验中Btk抑制剂可以通过抑制NLRP3炎性小体的激活从而减少IL-1β的表达;Btk抑制剂可通过抑制B淋巴细胞和DCs上CD86的表达从而影响T淋巴细胞的激活。研究结论1)Btk抑制剂可保护小鼠急性肝衰竭,Btk作为抗急性肝衰竭药物靶点具有良好的可行性与有效性;2)Btk抑制剂通过抑制NLRP3炎性小体激活从而降低IL-1β的表达,缓解“细胞因子风暴”的发生,从而减少肝细胞大量坏死;3)Btk抑制剂可抑制抗原提呈功能,减少T淋巴细胞激活,从而减轻T淋巴细胞介导的肝脏损伤。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.3
【图文】：

抑制剂,细胞因子,急性肝衰竭,小鼠

在观察到两种Ｂｔｋ抑制剂对ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ介导的小鼠急性肝衰竭均具有良好的逡逑保护作用之后，我们利用荧光定量ＰＣＲ技术检测了小鼠肝脏组织促炎因子ＴＮＦ－ｃｕ逡逑ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－６和抑炎因子ＩＬ－１０的表徶情况。如图２所示，与ＮＣ组小鼠相比，逡逑ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ组小鼠肝脏组织细胞因子ＴＮＦ－ｃｕ邋ＩＬ－ｌｐ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０等ｍＲＮＡ水平逡逑均明显上升，而Ｂｔｋ抑制剂的应用可有效降低ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－６的ｍＲＮＡ水平，逡逑ＩＬ－１０符合趋势但是无统计学意义。这表明，Ｂｔｋ抑制剂能调节促炎因子的表徶，逡逑改善ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ对肝脏免疫微环境的影响。逡逑２６逡逑

抑制剂,磷酸化,巨噬细胞,表达水平

细胞内Ｂｔｋ磷酸化水平在ＬＰＳ刺激下的表达变化。我们将ＲＡＷ２６４．７细胞分为四逡逑组，分别为ＮＣ组、Ａｃ－Ｉｂ组、ＬＰＳ组及Ａｃ－Ｉｂ＋ＬＰＳ组，处理６小时后，收集细胞逡逑并提取蛋白，利用＂ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测了邋ｐ－Ｂｔｋ／Ｂｔｋ的表达水平。如图３Ａ所示，与逡逑ＮＣ组相比，ＬＰＳ可明显提高巨噬细胞内Ｂｔｋ磷酸化水平而几乎不影响Ｂｔｋ总蛋白逡逑的表达水平；通过Ｂｔｋ抑制剂的预处理，可明显降低ＬＰＳ作用下的这一磷酸化过逡逑程。表明，ＬＰＳ可刺激巨噬细胞内Ｂｔｋ磷酸化水平的升高，这可能与ＬＰＳ的促炎逡逑作用有关；利用Ｂｔｋ抑制剂可能可以缓解巨噬细胞引起的炎症反应。逡逑下一步，我们分析了邋ＬＰＳ刺激下Ｂｔｋ抑制剂对ＲＡＷ２６４．７细胞内细胞因子表逡逑达水平的影响。我们将ＲＡＷ２６４．７细胞同样分为四组，分别为ＮＣ组、Ａｃ－Ｉｂ组、逡逑ＬＰＳ组及Ａｃ－Ｉｂ＋ＬＰＳ组，处理６小时后，收集细胞并提取ＲＮＡ，利用荧光定量ＰＣＲ逡逑检测ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｉｐ、ＩＬ－６和ＩＬ－１０的表达水平。结果如图３Ｂ－Ｅ示，与ＮＣ组相比，逡逑单一邋Ａｃ－Ｉｂ处理对四种细胞因子的ｎｉＲＮＡ均有轻微升高作用

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