基于GC-MS的代谢组学对急性百草枯中毒大鼠病情评估及损伤机制的研究

发布时间：2020-07-09 18:33

【摘要】：目的:基于气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)代谢组学技术筛选用于评估大鼠急性百草枯(PQ)中毒严重程度的血浆代谢物的生物标志物,为急性百草枯中毒的早期诊断及病情严重程度提供依据,同时探讨急性百草枯的中毒机制。方法:24只SD大鼠按随机数字表法分为生理盐水对照组、低剂量中毒组(40mg/Kg)、中剂量中毒组(80mg/Kg)、高剂量中毒组(120mg/Kg),每组6只。于灌胃后观察大鼠一般情况,在24h收集大鼠腹主动脉血,采用GC-MS方法检测血浆中内源性小分子代谢物,并进行代谢轮廓及随机森林分析,筛选潜在的生物标志物;同时检测大鼠肝肾功能。并采取HE染色观察百草枯中毒大鼠肺损伤程度。结果:(1)观察各组发现,40mg/Kg中毒组大鼠灌胃后表现出活动减少、食量减少等中毒症状,80mg/Kg中毒组大鼠症状较40mg/Kg组大鼠更重,并有呼吸急促,刺激后反应迟钝,120mg/Kg组反应相当迟钝,刺激后仍蜷缩不动,基本无饮水进食活动,还出现了呼吸费力、鼻部有泡沫样液体溢出等症状,并死亡1只;生理盐水对照组大鼠活动与食量正常,与灌胃前状态相差不大。(2)各组采用S-N-K(S)法进行比较,按α=0.05的水准,生理盐水对照组、40mg/Kg组、80mg/Kg组、120mg/Kg组大鼠血浆ALT、BUN、CR含量存在明显差异,且与剂量相关。采用非参数统计方法——Kruskal-Wallis H检验,按照α=0.05的水准,各组AST升高有差别。(3)采用HE染色观察百草枯中毒大鼠肺损伤情况,结果显示:生理盐水对照组肺泡结构清晰完整,肺泡腔及肺间质无渗出,无炎症细胞浸润。40mg/Kg组肺泡结构出现明显改变,可见部分肺泡塌陷,肺泡腔及肺间质可见少许渗出。80mg/Kg组、120mg/Kg组肺泡正常结构基本消失,肺泡闭塞塌陷,肺间质内炎症细胞浸润。(4)通过代谢物质谱图与NIST05标准质谱图库对比,选取相似度大于80%的组分作为已明确的代谢物组分进行定性,共定性出30种代谢物,与对照组比较有统计学差异的代谢物有14种,包括氨基酸、有机酸、糖类、脂肪酸。结合随机森林算法分析差异代谢物对中毒大鼠代谢轮廓特征变化贡献度发现,d-Erythrotetrofuranose、丙酸、L-丙氨酸、D-果糖、谷氨酰胺、苯乙酸是关键差异代谢物。对4组大鼠鉴别起到重要作用的代谢物的代谢途径主要是丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢。(5)采用典型相关对代谢物特征和临床特征进行分析,相关系数R为0.92,代谢物L-脯氨酸,L-苯丙氨酸,酪氨酸、肌醇和生化指标BUN对两组特征的相关性贡献最大。结论:(1)与对照组相比,中毒组出现各种症状时,肺损伤明显,且糖代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、能量代谢均发生了改变。(2)与对照组相比,中毒组L-丙氨酸、L-脯氨酸、谷氨酰胺、L-酪氨酸含量下降,苯乙酸、L-丝氨酸、亚油酸、反亚油酸含量增加,且与中毒剂量相关。(3)对4组大鼠分类起到重要作用的代谢物的代谢途径主要是丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,其通过影响ATP代谢及氮平衡造成全身脏器损伤。(4)代谢物和肝肾功能指标相关系数R为0.92,代谢物L-脯氨酸,L-苯丙氨酸,酪氨酸、肌醇和尿素氮对两组特征的相关性贡献最大。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R595.4
【图文】：

大鼠,毛发,症状,灌胃

3.1 大鼠一般情况在实验室适应的 2 天时间内，所有大鼠性情温顺，毛发顺而有光泽，饮食饮水良好，行动灵敏且好动，刺激后反应迅速，对抓捕行为可敏捷躲避或有攻击行为，体重随着时间的延长而有所增加。对所有大鼠予以对应的溶剂灌胃处理后（如图 3-1 所示），大鼠均未出现口鼻部有生理盐水或百草枯溶液溢出或呛咳的现象，提示灌胃成功。40mg/Kg 中毒组大鼠灌胃后表现偶有躁动，毛发光泽变暗，饮食饮水减少等中毒症状，80mg/Kg 中毒组大鼠症状逐渐加重，出现闭眼，蜷缩少动，毛发变乱，呼吸急促，刺激后反应变慢，120mg/Kg 中毒组反应迟钝，外界刺激下仍蜷缩不动，基本无饮水进食活动，还出现呼吸费力、鼻部泡沫样液体溢出等症状，并有 1 只大鼠死亡；生理盐水对照组大鼠则饮食活动正常，生命体征平稳，无不适症状。

病理切片,肺泡,肺组织,正常结构

见少许渗出。80mg/Kg、120mg/Kg 组肺泡正常结构基本消失，肺泡闭塞塌陷，肺间质内炎症细胞浸润。图3-2 不同浓度组大鼠肺部病理切片镜下观（10×40倍镜下）肺组织评分采用单因素方差分析可得 P<0.001，可得四组大鼠之间肺组织损

谱图,半定量分析,代谢物,总离子流

伤是有差异的；进而采用 Tukey’s Multiple Comparison Test 进行两两组间的对比，可得所有两两比较组间 P<0.05，任意两组间的差异均有统计学意义（如图 3-3）。图3-3 不同浓度组大鼠肺损伤半定量分析3.3 GC-MS 代谢组学分析3.3.1 GC-MS 定性分析前处理后的大鼠血浆样品经过 GC-MS 检测后，共得到含 30 个小分子代谢物成分的总离子流图（TIC），代表性谱图见图 3-4，可以看出图谱中色谱峰数量丰富，大部分代谢物都满足了完全分离。观察空白组和摄毒组的血浆代谢物总离子流图，可看出百草枯染毒的大鼠与正常大鼠的血浆小分子代谢物基本上一致，只是在代谢物的峰面积即含量上有区别。

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