程序性细胞坏死参与脑损伤后脑水肿的初步研究

发布时间：2020-07-10 17:25

【摘要】：脑水肿在我国是最常见的颅内急症,常见于脑缺血以及创伤性的脑损伤后。脑水肿治疗的及时性对患者的神经功能恢复至关重要,它也是脑损伤后高死亡率和高致残率的主要原因。临床上对于脑水肿的治疗主要限于高渗疗法,目前所使用的抗脑水肿药物也存在一定的局限。由于脑水肿发生的详细机制研究还不是很清楚,从而限制了新的抗脑水肿药物的开发。细胞坏死是多种脑损伤后损伤区域与及其损伤区周围的主要病理改变。程序性细胞坏死(necroptosis)是一种由细胞内受体相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase 3,RIP3)/混合谱系结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)信号介导的可控性的细胞坏死,是脑损伤及脑缺血后细胞死亡的主要方式之一。程序性细胞坏死是否参与脑损伤后脑水肿形成,至今未见研究。本项目采用颅脑开放性损伤模型、脑缺血模型,研究了脑损伤后程序性坏死关键分子RIP3、MLKL及脑水肿相关指标的表达;采用RIP3、MLKL基因敲除小鼠,研究了RIP3和MLKL在脑水肿发生中的作用,为阐明脑损伤后脑水肿的发生的机制提供了新的角度。目的揭示程序性细胞坏死关键分子MLKL和RIP3在小鼠损伤后脑水肿组织中的表达及作用,为脑损伤后脑水肿的机制研究和治疗策略提供新的思路。材料与方法脑损伤模型的建立:通过向野生型(Wild type,WT)和MLKL敲除(MLKL~(-/-))、RIP3敲除(RIP3~(-/-))小鼠尾静脉注射玫瑰红溶液(药量40 mg/kg、浓度6 mg/ml),构建缺血性脑损伤致脑水肿模型。另使用创伤模型的撞击装置,在撞击速度为2 m/s,深度为1.5 mm,持续时间为200 ms条件下冲击小鼠皮质,构建创伤性脑损伤后脑水肿模型。造模成功后,灌注取脑,制备冰冻切片,分别利用苏木精伊红染色(HE)技术及干湿重方法分析脑组织缺血及损伤后脑水肿情况;利用免疫荧光染色及免疫电镜技术观察程序性坏死/脑水肿关键基因MLKL/RIP3蛋白在脑水肿区域的表达和分布;利用蛋白质免疫印迹技术(Western Blot)检测小鼠脑水肿后MLKL/RIP3蛋白的表达情况及参与脑水肿调控的水通道蛋白-4(aquaporin,AQP4)的表达变化情况。结果1.脑损伤致脑水肿模型的建立:缺血后损伤后,HE染色显示缺血损伤后脑中线偏移,损伤侧脑组织有显著的水肿现象;开放性颅脑创伤后,脑组织干湿重测量显示创伤组脑组织水分含量显著增多。2.脑水肿组织中程序性坏死关键分子RIP3、MLKL的表达:Western Blot显示:脑缺血及创伤致脑水肿后,损伤侧MLKL及RIP3蛋白表达分布增加;免疫荧光双标染色显示:正常小鼠皮质无RIP3和MLKL表达,脑损伤后,MLKL及RIP3蛋白特异性分布于血管旁星形胶质细胞;免疫电镜研究显示:在水肿区,血管周围星形胶质细胞内有大量标记MLKL及RIP3的胶体金颗粒分布。3.程序性坏死在损伤后脑水肿中的作用:免疫组化及Western Blot结果显示,与野生型小鼠相比,RIP3、MLKL敲除小鼠损伤区AQP4表达增加,免疫球蛋白(IgG)渗出减少,水肿面积缩小,提示MLKL及RIP3可能参与调节脑水肿,可作为脑水肿治疗的潜在靶标。结论脑损伤可上调MLKL及RIP3的表达。水肿期,血管周围的星形胶质细胞表达MLKL和RIP3,发生程序性坏死。,敲除MLKL和RIP3基因可减轻损伤导致的脑水肿,提示程序性细胞坏死相关蛋白可能参与了脑水肿发生。
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R651.15
【图文】：

图 1-1 脑缺血模型的建立颅脑损伤模型的建立（图 1-2）2%巴比妥钠将小鼠麻醉，待麻醉后纵向剪开头皮，暴露颅 mm，脑中线左侧旁约 0.5 cm 处开孔，用镊子抛开露骨坏。装置撞击小鼠皮质开孔处，所用装置与平面垂直。冲击持续时间为 200 ms，使小鼠脑皮质出现中重度损伤。若止血处理，圆形钢头在冲击的过程中，注意固定好小鼠用碘伏消毒损伤部位，将剪开头皮缝合，关闭装置。置保暖处至其苏醒，72 h 后取组织。

图 1-1 脑缺血模型的建立放性颅脑损伤模型的建立（图 1-2）为2%巴比妥钠将小鼠麻醉，待麻醉后纵向剪开头皮，暴露颅骨，.5-2 mm，脑中线左侧旁约 0.5 cm 处开孔，用镊子抛开露骨，小破坏。模装置撞击小鼠皮质开孔处，所用装置与平面垂直。冲击速度m，持续时间为 200 ms，使小鼠脑皮质出现中重度损伤。若撞击予止血处理，圆形钢头在冲击的过程中，注意固定好小鼠头部，用碘伏消毒损伤部位，将剪开头皮缝合，关闭装置。放置保暖处至其苏醒，72 h 后取组织。

成都医学院硕士学位论文脑损伤模型的建立 脑缺血模型的建立及脑水肿的测量按照文献制备小鼠脑缺血模型[18, 19]。造模前，将假手术组和脑缺血组在统一环一周，然后通过尾静脉注射玫瑰红溶液制造缺血后脑水肿模型，造模结束后 7取组织，冰冻切片后进行 HE 染色。HE 染色结果显示，缺血组皮质区域有明显及脑组织肿胀，导致半球中线偏移。以损伤侧面积与正常脑组织侧面积的比值肿指数。结果发现缺血侧脑组织面积与正常侧脑组织面积的比值大于 1，提示缺肿胀(图 1-3)。实验结果

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本文编号：2749225