NF-кB信号通路在间充质干细胞调节巨噬细胞治疗烧伤脓毒症的作用研究

发布时间：2020-07-11 16:41

【摘要】：烧伤脓毒症的发生机制及治疗方法一直是研究的热点与重点。间充质干细胞具有较强的抗炎、免疫调节作用，可通过旁分泌各种细胞因子或与各种免疫细胞相互调节而发挥作用，用于炎症性或免疫性疾病的治疗。近年来已经在GVHD、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性肺损伤、急性肾功能损害、急性免疫性肝损伤等疾病，脂肪间充质干细胞取得了明显的治疗效果，但是针对严重烧伤脓毒症的治疗研究仍然甚少，且具体机制仍不十分清楚。首先，建立一个有效的完全模拟脓毒症发病机制的动物模型及分离扩增培养获得大量脂肪间充质干细胞非常关键。在第一部分实验，以C57/BL6J小鼠10%III°烫伤创面，接种2×10~5CFU铜绿假单胞菌建立小鼠烧伤脓毒症模型。实验结果：具有稳定的脓毒症发病率及死亡率，死亡率达50%-80%，；IL-1、IL-6、TNF-a及CRP等炎性因子明显升高，IL-6最高达20ng/ml；心、肝、脾、肺及肾脏细菌含量增高，其中脾脏含量最高；各脏器炎性细胞浸润及炎症损伤严重，可见大量的炎性细胞浸润及血性渗出；ALT、AST、BUN、Cr持续升高，肾功及肝功能明显下降。该实验表明该烧伤脓毒症模型有较高的死亡率和可重复的稳定性，并可进一步可发展为SIRS和MODS；该模型较好的反应了烧伤脓毒症的病理机制及临床特征。在第二部分实验采用酶消化、贴壁筛选以及差速离心法分离培养小鼠脂肪间充质干细胞，通过流式细胞分析获得90%以上的CD90、CD105、CD44表达阳性，以及90%以上的CD34、CD45表达阴性的；同时通过油红O及碱性磷酸酶染色证明该细胞是有向成脂、成骨多向分化能力的脂肪来源的间充质干细胞。在第三部分实验在脓毒症模型制备6h后，运用2×105脂肪间充质干细胞输注治疗小鼠烧伤脓毒症，观察小鼠的一般状况、生存率，检测全身各脏器细菌及内毒素定量、各脏器功能，以及促炎/抗炎因子的改变，明确脂肪间充质干细胞在烧伤脓毒症的治疗作用。实验结果表明：1、小鼠一般状况、自主活动及对外界的反应都有明显改善；2、小鼠24h、48h至72h脏器的细菌含量明显减少，而脾脏细菌定量变化最大，心脏的变化最小；3、随时间延长，TNF-、IL-12表达明显下降及抗炎因子IL-10表达明显升高，血清中TNF-、IL-6等促炎症因子及抗炎因子IL-10变化也是相同的。4、各脏器组织HE染色示炎性细胞浸润明显减少，肝小叶放射状结构保持完整；肾脏组织肾小管坏死细胞明显减少，肺间质增厚及肺泡内的血性渗出明显改善，肝、肺及肾脏组织细胞坏死凋亡明显减少，脏器功能得到改善。这些实验结果表明，脂肪间充质干细胞治疗烧伤脓毒症得到了肯定的疗效。在第四部分实验体外单独或共培养脂肪间充质干细胞与Raw264.7小鼠巨噬细胞，以探讨脂肪间充质干细胞调节巨噬细胞及其NF-кB信号通路在干细胞治疗脓毒症可能的作用机制。将细胞分为四组：正常对照组、LPS刺激组、Transwell组、混合细胞组。实验结果证明：1、经LPS刺激后，促炎因子TNF-a、IL-6及抗炎因子TGF-b均有明显升高，但随时间延长，抗炎因子迅速下降，而促炎因子持续升高；当细胞共培养时，促炎因子明显下降，抗炎因子明显升高，其中促炎因子TNF-a，及抗炎因子COX-2变化最明显。2、经LPS刺激24h后，CD206阳性细胞增幅10%；随时间延长，LPS刺激组CD206阳性细胞无明显变化；但细胞Transwell及混合细胞共培养组，分别由23.3%增至38.5%，24.2%增至52.7%，较LPS刺激组有显著的提高，且发现，混合细胞组CD206的细胞比例最高，具有统计学差异。3、间充质干细胞共培养组，细胞内的P65的核转位及其上游分子p-IKB-a、p-IKK-a的磷酸化水平明显抑制。该实验结果表明，脂肪间充质干细胞可能不仅通过旁分泌的作用来调节巨噬细胞，还可通过与巨噬细胞间接触而发挥调节的作用。其中PGE2及NF-кB信号通路可能是间充质干细胞调节巨噬细胞变化的关键性因素，也是间充质干细胞
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R459.7
【图文】：

巨噬细胞,巨噬细胞系,炎性细胞因子,黏附分子

第四军医大学博士学位论文细胞产生前列腺素的能力大大增强[11]。③环氧合酶抑制剂可以从多个患者的免疫功能，提高生存率[12][92]。核巨噬细胞系统的活化与作用毒素、炎性细胞因子及其分泌大量黏附分子、增加血管通透性，进一巨噬细胞向组织内游走并转化为巨噬细胞的过程。因此，单核巨噬细烧伤脓毒症的关键环节[13-14]。 M1/M2 型巨噬细胞

信号通路,信号,间充质干细胞,多化

图 2 TLR4 信号介导的 MyD88 依赖/不依赖的通路及 NF-кB 信号通路、间充质干细胞. 间充质干细胞起源及生物特性1974 年 Friedenstein 等[25]发现贴壁的骨髓细胞在一定条件下可分化为成骨细胞骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞，而且这些细胞经过多个培养周期仍可以保持多化的潜能。由于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞

潜能,白蛋白,胰岛素,肝细胞

tidine)和两性霉素 B 共同作用，促使 BMSCs 体外分化[46]用 5-氮杂胞苷处理永生化小鼠 BMSCs 发现 24h 后变化，细胞相互铰链形成肌管样结构，并可自主搏动，肽的表达。电镜下可见类似心肌的超微结构[94]。等[47]研究证实 MSCs 具有可以向肝细胞分化的能力，松、制瘤素、ITS+添加剂等混合诱导条件，观察 21d，48d 后细胞进一步成熟，进一步通过 RT-PCR 定期检白、白蛋白、细胞角蛋白 18、酪氨酸转氨酶等均呈持诱导后 1 周 70%的细胞表达白蛋白，6 周后肝细胞样细8]采用含烟酞胺、β-巯基乙醇培养液将大鼠骨髓 MSCs免疫组化法分别检测到胰岛素-1 mRNA 和蛋白持续阳分化的细胞分泌胰岛素的量远远超过未分化细胞。

【参考文献】