急性肺损伤后AEC2s的修复作用与调控机制研究

发布时间：2020-07-27 16:10

【摘要】：急性肺损伤是重症监护病房(ICU)患者呼吸衰竭最常见的原因之一。它是肺实质疾病的一种特征性形式,代表了从短暂的呼吸困难到呼吸系统的快速终末衰竭(急性呼吸窘迫综合征,ARDS)等多种严重状态。与其他器官如肝脏和皮肤相比,成人肺在稳态条件下被认为是静止的。然而,最近的研究表明,肺具有兼性干细胞/祖细胞群,在损伤后具有很大的修复潜力。肺泡是由扁平上皮肺泡1型细胞(AEC1s)和分泌表面活性物质的立方上皮肺泡2型细胞(AEC2s)排列组成的气体交换囊。AEC2s作为肺祖细胞已经被广泛认可,并参与肺的修复和再生过程。在发育过程中,AEC1s和AEC2s来自于来源于一种有双向分化潜能的祖细胞谱系,而在出生后,AEC2s可以经历长期的自我更新,并在稳态时分化补充AEC1s。因此,AEC2s作为一群干/祖细胞,在体内增殖并在肺损伤时产生AEC1s。了解肺泡上皮细胞再生能力的机制,可为ALI的治疗提供理论基础。本研究旨在明确急性肺损伤后肺泡上皮的增殖再生能力,同时对肺泡上皮再生的机制进行深入探讨。我们建立了LPS诱导的急性肺损伤模型,利用谱系示踪技术和免疫染色的方法,观测急性肺损伤后不同时间点AEC2s的数量变化,发现损伤后AEC2s的在不同时间点和不同损伤区域有不同的增殖和分化特性。AEC2s在损伤后3天增殖最明显,而增殖主要是出现在损伤区域。通过蛋白质组学高通量筛选发现Hippo通路在肺损伤后的变化与AEC2s增殖规律高度一致,且实验发现Hippo通路关键蛋白YAP1主要在损伤肺的AEC2s中表达;而细胞实验证明抑制YAP1的表达将导致A549细胞增殖减弱。实验结果表明,Hippo-Yap1信号通路在急性肺损伤后的肺组织干祖细胞再生中参与了细胞增殖的调控,发挥着重要作用。方法:利用蛋白质质谱spectrometry-based大规模筛选和谱系示踪技术标记AEC2s,我们分析了不同肺损伤天数和损伤区域AEC2s增殖和迁移情况。然后通过免疫荧光染色、免疫组织化学和体外实验验证了肺泡上皮细胞增殖的机制。结果:1、经气管内滴注肺损伤小鼠模型,当LPS剂量为10mg/kg LPS(O55:B5),滴注体积为每只小鼠50ul时,建立的急性肺损伤模型伤情较为适合。在伤后3、5、7天取材,肺大体和HE染色发现肺损伤在损伤后3天内加重,12天后完全恢复正常。不同的损伤区域伤情不同,肺门附近损伤最严重,肺周围损伤最轻。2、Sftpc-CreER~(T2);Rosa26-RFP双杂合小鼠(Sftpc-CreER~(T2);Rosa26-RFP)给予4次他莫昔芬(0.1-0.15 mg/g体重)谱系标记小鼠AEC2s,最后一次注射他莫昔芬后7天处死,约89.2%Sftpc+细胞谱系标记。免疫组织化学、位置和细胞形态学分析证实绝大多数RFP+细胞(99.4%±7%)都是AEC2s。3、ALI后3天AEC2s细胞数目最大(205.20±46.14个/HPF,P0.05),损伤后5天、7天细胞数目仍明显多于对照组(188.29±55.58个/HPF,195.73±60.06个/HPF,P0.05);不同天数的不同损伤区域,损伤区域和损伤-正常交界区域与对照组相比,细胞数目明显增高(P0.05),而正常区域与对照组相比则基本无变化(P0.05)。4、我们通过蛋白质组学分析通路富集发现Hippo-YAP1通路在肺损伤修复过程中可能发挥重要作用。免疫荧光染色和免疫组化证明了Hippo-YAP1通路关键蛋白YAP的高表达与ALI后AEC2s增殖规律一致。此外,结果显示ALI后肺组织YAP1阳性细胞主要为Sftpc谱系标记的AEC2s。AEC2s体外增殖实验表明,YAP1 siRNA和Hippo抑制剂均能显著抑制AEC2s的增殖。结论:急性肺ALI后AEC2s是肺泡上皮修复的主要干/祖细胞。伤后3至7天AEC2s增殖明显。Hippo-YAP信号通路参与调控ALI后肺AEC2s增殖,使用YAP-TEAD抑制剂和siRNA抑制YAP的作用,可以抑制AEC2s的增殖。表明Hippo-YAP信号通路是一个急性肺损伤后,肺组织修复与再生中的重要通路,通过调控该通路的活化,可能会为急性肺损伤以后的修复提供新的思路。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563.8
【图文】：

图 1-1 小鼠繁育杂交示意图2.5.1.2 转基因小鼠基因型鉴定方法(1)剪尾：消毒眼科剪剪取 2 周龄小鼠鼠尾 0.5cm，置于干净的 1.5ml 离心管中，并编号标记；(2) 鼠尾 DNA 提取：利用血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒提取鼠尾 DNA。（详细步骤参照血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒）；(3) DNA 质量检测：DNA 振荡混匀后，取 1ul DNA 用 Nanodrop 分光光度计检测获得 DNA 浓度、A260/A280 值。(4) PCR 扩增A、引物信息（引物序列为 Jackson Lab 官网提供，由华大基因科技股份有限公司合成。）表 1-1 鉴定基因的引物序列

图 1-2 取材位置示意图图机肺大体照相。材、石蜡切片kg 戊巴比妥钠溶液麻醉，后肢内侧肌卧位固定，从下腹部沿正中线剪开皮肤行气管插管。动静脉，剪断血管放血，向上剪破膈经气管灌注 400ul 4%多聚甲醛（4℃4℃预冷）的血清瓶中继续 4℃固定过m）。

图 1-2 取材位置示意图大体照相。石蜡切片巴比妥钠溶液麻醉，后肢内固定，从下腹部沿正中线剪开管插管。脉，剪断血管放血，向上剪管灌注 400ul 4%多聚甲醛（预冷）的血清瓶中继续 4℃固

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本文编号：2772067