Tim-3对小胶质细胞和创伤性脑损伤的调节作用及机制研究

发布时间：2020-07-27 18:53

【摘要】：研究背景巨噬细胞在免疫稳态调控中发挥关键作用,其功能异常与多种急慢性、非可控性炎症的发生发展密切相关,是多种疾病的干预靶标。小胶质细胞作为脑内的巨噬细胞,在生理情况下,通过吞噬防御、免疫应答、神经营养、突触重塑等多种作用,在维持神经免疫稳态中发挥重要作用。而病理情况下,小胶质细胞过度活化,免疫应答失控,分泌大量炎症介质,则会造成免疫损伤。小胶质细胞的功能与其极化状态密切相关。活化的小胶质细胞具有“经典激活”(M1)和“替代激活”(M2)两种状态,具体状态取决于它们所处的环境和周围的刺激因素。M1型小胶质细胞诱导iNOS和NF-κB通路的活化进而产生各种促炎细胞因子,如TNF-α、IL-1β和IL-6以及超氧化物、活性氧和一氧化氮等。M2型小胶质细胞能够促进组织修复,分泌神经营养因子以及TGF-β等抑炎细胞因子。小胶质细胞通过M1/M2不同方向的极化,发挥增强炎症反应(M1)或促进炎症修复(M2)的作用。在脑创伤的情况下,小胶质细胞活化过度、M1极化增强是引发“二次创伤”及创伤后应激反应综合征(post-traumatic stress disorder,PTSD)的重要因素。此外,在阿尔茨海默症中,小胶质细胞过早向M2极化不利于β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)的清除等。可见及时调控小胶质细胞的极化对于防治脑损伤、预防脑功能障碍等具有重要意义。创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)在战时和平时,因其高发病率和致死致残率,给国家和人民带来沉重的医疗负担和巨大的生命财产损失。其中,非可控的级联放大炎症反应是TBI的致病机理之一,而小胶质细胞的活化失控是这一级联放大炎症反应的关键因素。由于TBI致病机理的复杂性,至今缺乏有效的干预措施。因此,深入了解TBI的损伤机制,寻找潜在干预靶点,对于减少战斗减员、减轻社会负担都具有重要意义。T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule-3,Tim-3)广泛表达于活化的T细胞、巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞,是新近发现的免疫检查点分子。近年来,Tim-3因其自身重要的免疫调节功能,引起免疫学界的广泛关注。目前,对Tim-3的研究都集中在其对T细胞功能的调控上。我们实验室长期关注巨噬细胞功能的调控,并率先发现Tim-3在体外通过多种机制调节巨噬细胞的功能,在维持天然免疫稳态方面发挥着重要作用。而且,实验室进一步的研究数据表明,干预Tim-3信号可以通过重塑巨噬细胞的功能影响疾病进展。因此,能否通过干预Tim-3的信号来调控小胶质细胞的功能,进而影响TBI的发生发展,成为本研究着重解决的科学问题。研究目的探究Tim-3对神经小胶质细胞极化的调节作用及机制;利用小鼠建立创伤性脑损伤疾病模型;构建和扩大繁殖Tim-3(HAVCR2)敲除模式小鼠;探究Tim-3对创伤性脑损伤的调节作用。方法及结果本研究共分4个部分,即Tim-3对神经小胶质细胞的调节作用及机制、创伤性脑损伤小鼠模型的建立及评价、Tim-3敲除模式小鼠的构建及鉴定、Tim-3对创伤性脑损伤调节作用的初步探究。1 Tim-3对神经小胶质细胞的调节作用及机制研究借助流式细胞术检测神经小胶质细胞BV-2上Tim-3及其配体的表达情况;利用ELISA、实时荧光定量PCR检测阻断Tim-3信号对BV-2细胞炎症因子表达的影响,进而明确Tim-3对小胶质细胞M1/M2极化的调控作用;通过免疫印迹阐明Tim-3调控小胶质细胞极化的分子机制。结果:Tim-3及其配体分子半乳糖凝集素-9(galectin-9,Gal-9)表达于BV-2细胞;阻断Tim-3信号显著增强了BV-2细胞M1极化相关的促炎性细胞因子,包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis Factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素12(interleukin-12,IL-12)的表达,抑制了M2极化相关的抗炎性细胞因子,如白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)和转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)的表达,提示Tim-3参与了小胶质细胞极化的调控。同时,分子机制研究发现,Tim-3可能通过抑制小胶质细胞中视黄酸诱导基因I(retinoic acid-induced gene protein I,RIG-I)和核因子κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)的表达及活化发挥极化调控功能。2创伤性脑损伤小鼠模型的建立及评价雄性C57BL/6小鼠,随机分为Sham组(对照组)和CCI组(控制性皮质撞击,下文统称TBI(CCI)),每组20只,经腹腔麻醉后,暴露硬脑膜,用电子控制性皮质撞击仪对小鼠脑皮质实施打击;在打击前和打击后24小时,依据神经功能损伤严重程度量表(neurological severity score,NSS),进行NSS评分,并取脑组织进行HE染色,依据NSS评分结果和HE染色结果,评价模型建立情况。结果:两组小鼠均成活,基于NSS评分结果和HE染色结果,TBI(CCI)组为中度损伤。3 Tim-3敲除模式小鼠的构建及扩大繁殖利用商品化的HAVCR2-Floxed重组转基因小鼠交配筛选出Flox~(+/+)纯合型小鼠;利用Flox~(+/+)纯合型小鼠和商品化的EIIa-Cre重组转基因小鼠(Cre~(+/+)或Cre~(+/-)均可表达Cre酶)交配筛选出Flox~(+/+)Cre+小鼠;提取小鼠基因组DNA和脑组织RNA及总蛋白,通过PCR、实时荧光定量PCR和免疫印迹检验Tim-3的敲除效果。结果:小鼠基因组DNA电泳结果表明,成功获得了Flox~(+/+)纯合型小鼠和Flox~(+/+)Cre+小鼠;实时荧光定量PCR和免疫印迹结果表明,Tim-3敲除模式小鼠脑组织内Tim-3的mRNA水平和蛋白水平均显著降低。4 Tim-3对创伤性脑损伤调节作用的初步探究野生型(Wild type,WT)小鼠和Tim-3敲除(Knock out,KO)模式小鼠,每组20只,建立TBI(CCI)模型。分别在损伤前、损伤后12小时、24小时依据神经功能损伤严重程度量表(neurological severity score,NSS),进行NSS评分,评估模型建立情况和神经功能损伤差异;并提取伤灶周围脑皮质的RNA,通过实时荧光定量PCR检测WT小鼠和KO小鼠伤后脑内炎症因子表达差异,探究Tim-3对创伤性脑损伤的调控作用。结果:成功利用WT小鼠和KO小鼠复制了中度TBI(CCI)模型;伤后12小时,Tim-3能够降低神经功能损伤程度、抑制I型干扰素的表达;伤后24小时,两组小鼠的NSS评分和TNF-α及IL-1β等炎症因子表达水平差异不明显。结论1 Tim-3参与了神经小胶质细胞BV-2的极化调控,抑制其M1极化,促进其M2极化。2成功在C57BL/6小鼠模拟了创伤性脑损伤疾病模型,经评价确定建立了TBI(CCI)中度损伤模型。3构建和扩大繁殖了Tim-3敲除模式小鼠,为研究Tim-3对创伤性脑损伤等脑功能障碍性疾病的调控作用奠定了基础。4利用野生C57BL/6小鼠和自行构建、扩大繁殖的Tim-3敲除模式小鼠,成功复制了TBI(CCI)模型;初步探究了Tim-3在创伤性脑损伤疾病模型中对神经功能损伤和炎症反应的影响,伤后12小时,Tim-3对神经功能损伤有保护作用,并且抑制I型干扰素的表达。以上研究结果,将有助于探明Tim-3对创伤性脑损伤的调控作用,发现潜在的干预治疗靶点,进而为探索治疗脑损伤及相关脑功能障碍性疾病的新策略,提供新的实验依据和方向。创新点本研究以免疫检查分子Tim-3为研究对象,首先从细胞水平上较为深入地探讨了其对小胶质细胞BV-2的极化调节作用及分子机制;根据实验需要,建立了小鼠控制性皮质撞击(CCI)中度损伤模型;利用两种不同基因背景的重组转基因小鼠,成功构建并扩大繁殖了Tim-3敲除模式小鼠;首次利用Tim-3敲除模式小鼠复制了创伤性脑损伤疾病模型,探究Tim-3对神经免疫稳态的调节作用。在探究中发现,伤后12小时,Tim-3对神经功能损伤有保护作用,并且抑制I型干扰素的表达,而在对TNF-α、IL-1β等炎症因子的影响尚未获得明确的结果,我们正在调整与完善相关实验方案,进一步开展相关研究。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R651.15
【图文】：

小胶质细胞,流式细胞仪检测,共培养

军事科学院硕士学位论文第 10 页配体Galectin-9（图1B）表达于BV-2细胞表面。以上研究结果，为分析Tim-3对小胶质细胞的调控作用奠定了基础。图 1 流式细胞仪检测 Tim-3 和 Gal-9 在小胶质细胞 BV-2 的表达情况阴影部分为同型对照抗体的染色结果。2.2 阻断Tim-3信号通路显著增强了小胶质细胞促炎性细胞因子的表达为了探讨Tim-3分子对小胶质细胞极化的影响，参考文献的方法[47]，我们用Tim-3融合蛋白与小胶质细胞共培养的方法阻断细胞上的Tim-3与其配体的结合，然后用ELISA及定量PCR的方法检测了小胶质细胞中M1型细胞因子包括TNF-α等细胞因子的表达情况。结果显示，Tim-3融合蛋白与小胶质细胞共培养12h后，IL-1β、IL-12a、IFN-β1和IFN-α4的mRNA基因表达上调，共培养24h后

小胶质细胞,共培养,融合蛋白,细胞

图 1 流式细胞仪检测 Tim-3 和 Gal-9 在小胶质细胞 BV-2 的表达情况阴影部分为同型对照抗体的染色结果。2.2 阻断Tim-3信号通路显著增强了小胶质细胞促炎性细胞因子的表达为了探讨Tim-3分子对小胶质细胞极化的影响，参考文献的方法[47]，我们用-3融合蛋白与小胶质细胞共培养的方法阻断细胞上的Tim-3与其配体的结合，然用ELISA及定量PCR的方法检测了小胶质细胞中M1型细胞因子包括TNF-α等细胞子的表达情况。结果显示，Tim-3融合蛋白与小胶质细胞共培养12h后，IL-1β、12a、IFN-β1和IFN-α4的mRNA基因表达上调，共培养24h后，IL-6和TNF-α的蛋表达显著上调（图2），提示Tim-3抑制神经小胶质细胞促炎细胞因子的表达，显抑制其M1型极化。

小胶质细胞,融合蛋白,共培养,神经

军事科学院硕士学位论文2.3 阻断Tim-3信号通路显著抑制了小胶质细胞抗炎性细胞因子的表达同样，我们用Tim-3融合蛋白阻断的方法，观察了Tim-3对小胶质细胞M2型细胞因子，包括TGF-β和IL-10以及M2细胞的标志分子Arg-1表达的影响。结果显示,Tim-3融合蛋白与小胶质细胞共培养36h后，IL-10、TGF-β和Arg-1的mRNA基因表达下降（图3），提示Tim-3促进小胶质细胞的M2型极化。

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