NASH进展中肠道微生态的结构和功能紊乱及丁酸的保护作用

发布时间：2020-08-08 17:17

【摘要】：研究背景:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoho lic fatty liver disease,NAFLD)目前已成为全球主要的慢性肝病和公共卫生问题,但人们对NAFLD的发病机制仍知之甚少,学界主流认为的“二次打击”假说并不足以解释这种异质性疾病的发病机制。目前发现肠道微生态是被遗忘的一大人体新陈代谢器官,它具有维持能量稳态等重要的生理学作用。迄今为止肠道微生态在NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)发生发展中的作用正被人们逐渐揭示。然而,NAFLD发展至NASH的过程中,肠道微生态结构及功能的动态改变至今仍缺乏相关研究。丁酸是短链脂肪酸的重要成员,目前已发现丁酸具有抗炎、调节脂质代谢、促进细胞凋亡、促进免疫稳态、改善肠道屏障的作用。然而,丁酸是否可以通过调节肠道微生态的结构及功能发挥对NASH的保护作用仍未可知。因此针对以上背景,本文计划研究NASH进展过程中肠道微生态结构及功能的动态变化及丁酸的保护作用。研究方法:本研究分两部分,第一部分通过构建蛋氨酸-胆碱缺乏(Methionine-choline-deficient,MCD)饮食诱导的NASH小鼠模型,动态监测小鼠从单纯脂肪变性(饲喂2周)至NASH(饲喂4周)过程中肠道微生态结构及功能的变化,构建微生物组及代谢组的联合分析模式。本部分共设四组,Control 2w组、MCD 2w组、Control 4w组、MCD 4w组。第二部分在构建NASH小鼠模型的基础上,每日予丁酸钠(Sodium butyrate,SoB)灌胃处理共6周,研究丁酸对NASH的保护作用,以及对NASH小鼠肠道微生态结构及功能的重塑作用,本部分共设四组,Control 组、MCD 组、Control+SoB 组、MCD+SoB 组。研究结果:第一部分:1.MCD饮食饲喂小鼠2周后出现单纯脂肪变性,4周后出现NASH。单纯脂肪变性进展到NASH的过程中,丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST),肝内甘油三酯(Triglycerides,TG)含量,NAFLD 活动度评分(NAFLD activity score,NAS)均升高,巨噬细胞浸润程度不断增强,ZO-1免疫荧光染色提示肠屏障破坏程度不断增加。NASH小鼠伴随出现肝纤维化。2.单纯脂肪变性小鼠肠道微生态结构改变不明显,但进展至NASH后开始出现肠道菌群紊乱。机会致病菌:嗜胆菌属(Bilophila)、厌氧菌属(Anaerotruncus)、梭菌属(Clostridium)、螺旋杆菌科(Helicobacteraceae)的丰度在NASH中显著提高。而益生菌萨特氏菌属(Sutterella)、阿克曼菌属(Akkermansia)丰度在NASH中显著降低。3.肠道菌群代谢功能在NASH进展中持续改变。四个实验组在主成分分析(Principal component analysis,PCA)及有监督的正交偏最小二乘法分析(Orthogonal partial least-squares-discriminant analysis,OPLS-DA)中均能明显区分。花生酸在正常组稳定存在,二十四烷酸在NASH进展中持续存在。最终分别在MCD饮食饲喂2周和4周后鉴定出103种和93种差异代谢物,其中大部分涉及与脂质、氨基酸、碳水化合物、核苷酸、辅因子和维生素代谢相关的通路。第二部分:1.丁酸可改善肝脏损伤、炎症及脂质代谢。肝脏HE染色显示,丁酸可降低MCD饮食诱导的肝细胞脂肪变性及炎症,降低NAS评分,改善肝功能(ALT、AST),降低甘油三酯含量,调控炎症及脂质代谢相关因子的mRNA表达量。2.丁酸可延缓肝纤维化进展并调节Toll样受体表达。丁酸干预后肝纤维化指标:TGF-β1、α-SMA表达量降低,MASSON染色及α-SMA免疫组化染色结果证实肝纤维化得到改善。TLR4、CD14 mRNA表达量降低。3.丁酸改善了血清细胞因子并降低内毒素水平。丁酸干预不仅显著下调了促炎细胞因子(IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-3,IL-6,IL-12p70,IL-17a,TNF-α,Eotaxin)的水平,也显著上调了抗炎细胞因子IL-4和IL-10的水平。丁酸干预组血清内毒素结合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein,LBP)水平较 MCD 组小鼠显著降低。4.丁酸可稳定结肠屏障功能。肠道屏障指标ZO-1,claudin-1 mRNA表达量在丁酸干预组上调。ZO-1免疫荧光染色证实该组肠屏障功能得到改善。5.丁酸重塑了 MCD饮食诱导的肠道微生态结构紊乱。主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCoA)结果显示,四个实验组的微生态结构可以良好区分,线性判别分析效应大小((Linear discriminant analysis effect size,LEfSe)分析显示丁酸可重塑肠道菌群结构,显著提高一些益生菌如阿克曼菌(Akkermansia)、罗氏菌属(Roseburia)的丰度。6.丁酸改善了 MCD饮食诱导的肠道微生态功能紊乱。OPLS-DA模型显示MCD组和MCD+SoB组可明显区分。两组间最终筛选出98种差异代谢物,饱和脂肪酸(如硬脂酸和二十二烷酸),不饱和脂肪酸(如油酸和亚油酸)和角鲨烯(一种天然的30碳三萜)的含量在MCD+SoB组小鼠的粪便中显著增加,花生四烯酸(一种不饱和脂肪酸)的含量在该组显著降低。7.丁酸重塑的肠道微生态结构及功能在改善NASH中具有重要作用。在NASH中丰度显著升高的嗜胆菌属(Bilophila)、理研菌科(Rikenellaceae)与ALT、IL-17α、LBP、TLR2、TLR4、TNF-α水平正相关;丁酸干预后丰度显著升高的益生菌阿克曼菌属(Akkermansia)与 ALT、NAS、TG、F4/80、IL-12 p70、IL-17α、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、TLR2、TLR4、LBP负相关;丁酸干预后丰度升高的代谢物角鲨烯、硬脂酸可能与改善肝脏损伤有关,它们均与ALT、IL-1β、IL-17α、LBP、F4/80 负相关。结论:1.MCD饮食诱导了肠道菌群结构及功能的实质改变。对这些改变的基础了解将为NASH及其相关的肠道功能紊乱的肠道靶向治疗提供新的依据。本部分研究为第二部分丁酸干预研究提供了模型及技术基础。2.丁酸可诱导肠道微生态结构及功能的保护性改变,从而有效地预防MCD饮食诱导的与NASH相关的肝脏和肠道损伤。口服丁酸钠可能是比较有前景的NASH治疗策略。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.3
【图文】：

肝损伤,脂肪,肝纤维化,小鼠

３．２邋ＭＣＤ饮食喂食４周后小鼠出现肝纤维化逡逑Ｍａｓｓｏｎ染色和ａ－ＳＭＡ免疫组织化学染色并未发现ＭＣＤ饮食喂食小鼠２周后，逡逑出现肝纤维化的证据（图３．２）。根据Ｍａｓｓｏｎ染色计算的肝纤维化指数（％）定量逡逑结果显示Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ组为２．１７邋±０．３０％，邋ＭＣＤ２ｗ组为．２．６９邋±０．２６％，两组比较无逡逑２１逡逑

肝纤维化,小鼠,油红

Ｃｏｎｉｒｏｌ邋２ｗ邋ＭＣＤ邋２ｗ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋４ｗ邋ＭＣＤ邋４ｗ逦Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ邋ＭＣＤ邋２ｗ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋４＼ｖ邋ＭＣＤ邋４ｖｖ逡逑图３．１邋ＭＣＤ饮食诱导的肝损伤，脂肪堆积和巨噬细胞浸润。Ａ－Ｃ：通过ＨＥ染色逡逑（Ａ），油红０染色（Ｂ）和巨噬细胞（Ｆ４／８０）染色（Ｃ）评估肝脏组织病理学改逡逑变。比例尺：２５０邋ｐｍ。Ｄ：由平均光密度表示的油红Ｏ染色强度。Ｅ：通过Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ逡逑Ｐｌｕｓ软件对Ｆ４／８０阳性细胞进行计数的百分比。数据以平均值±ＳＥＭ表示。每组小逡逑鼠只数邋ｎ邋＝邋６。＊＊Ｐ邋＜０．０１；＊＊＊邋Ｐ＜０．００１。逡逑３．２邋ＭＣＤ饮食喂食４周后小鼠出现肝纤维化逡逑Ｍａｓｓｏｎ染色和ａ－ＳＭＡ免疫组织化学染色并未发现ＭＣＤ饮食喂食小鼠２周后，逡逑出现肝纤维化的证据（图３．２）。根据Ｍａｓｓｏｎ染色计算的肝纤维化指数（％）定量逡逑结果显示Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ组为２．１７邋±０．３０％，邋ＭＣＤ２ｗ组为．２．６９邋±０．２６％，两组比较无逡逑２１逡逑

肠屏障功能,小鼠

Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ组小鼠结肠上皮细胞表面的ＺＯ－１蛋白光滑连续致密，无中断无破坏，逡逑而ＭＣＤ邋２ｗ姐小鼠的结肠组织顶面和隐窝部位表现出结构破坏和紊乱，中间有几逡逑处缺失，ＺＯ－１蛋白表达水平降低（图３．３）。同Ｃｏｎｔｒｏｌ邋２ｗ组，Ｃｏｎｔｒｏｌ邋４ｗ组小鼠逡逑结肠上皮细胞表面的ＺＯ－１蛋白连续表达，结构完整无中断。而喂食ＭＣＤ饮食４逡逑周的小鼠肠屏障功能进一步受损，表现为更加严重的蛋白缺失和大片段断层，蛋逡逑白覆盖厚度较Ｃｏｎｔｒｏｌ４ｗ组明显降低（图３．３）。逡逑２３逡逑

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