异甘草素对脂多糖诱导小鼠急性呼吸窘迫综合征保护作用及机制研究
发布时间：2020-08-07 01:33
【摘要】：目的:急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种以肺实质弥漫性炎症和顽固性低氧血症为特征的临床危重症。革兰阴性细菌感染作为ARDS发生的重要原因之一,其主要的致病成分脂多糖(LPS)可诱导显著的氧化应激和炎症反应,此二者被认为在ARDS发病机理中居于重要地位并且具有彼此促进、相辅相成的特点。因此,靶向氧化应激和炎症应答的治疗手段,可能为ARDS的临床防治提供新的思路。近年来,中药单体尤其是黄酮类化合物即因其优良的抗氧化和抗炎活性而备受关注。异甘草素作为一种来源于甘草根的黄酮类化合物,同样具有抗氧化、抗炎等多重药理活性。然而目前关于异甘草素在LPS诱导的ARDS中是否具有保护作用及其机制尚有待进一步研究。方法:本实验拟构建体外和体内两种模型,研究异甘草素在RAW 264.7细胞和ARDS模型中的保护作用及其机制。体外实验中,我们在RAW 264.7细胞中分别以叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导氧化应激观察其体外抗氧化活性和机制;以LPS诱导炎症反应观察其体外抗炎活性和机制,并进一步研究了其抗氧化机制与抗炎机制间的相互关系,在此过程中主要应用MTT法、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫印迹法(Western Blot)、质粒转染等分子生物学方法。体内实验中,我们以LPS构建小鼠ARDS的模型,在体外实验基础上进一步研究异甘草素对LPS诱导小鼠ARDS模型中氧化和炎症性损伤的保护作用和分子机制,并且在此基础上选用基因敲除小鼠深入探究其抗氧化机制与抗炎机制间的相互关系,在此过程中主要应用酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫印迹法(Western Blot)、流式细胞术(FCM)等分子生物学方法。结果:1.在体外,异甘草素具有良好的抗氧化和抗炎活性,表现在其对t-BHP诱导的细胞毒性、ROS产生和LPS诱导的iNOS、COX-2产生以及细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)分泌的显著抑制。异甘草素上调AMPK/Nrf2通路并可能由此介导了其抗氧化活性,同时它还通过对NF-κB通路和NLRP3炎症小体激活的抑制作用发挥抗炎活性,且对后者的抑制效应至少部分与Nrf2活化有关。2.在体内,异甘草素显著改善小鼠ARDS模型中LPS诱导的肺组织病理改变,减轻小鼠肺水肿程度,并且能够抑制BALF中ROS产生、炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞)渗出和细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)分泌,降低肺组织中MPO、MDA产生,GSH、SOD消耗,以及iNOS、COX-2表达。这种作用可能与其上调肺组织中AMPK/Nrf2/ARE通路和抑制LPS诱导的NF-κB通路活化和NLRP3炎症小体激活密切相关。3.相比于野生型小鼠,Nrf2~(-/-)小鼠中ARDS模型中异甘草素减轻LPS诱导的肺组织病理改变、腹腔巨噬细胞ROS产生以及抑制小鼠肺组织NLRP3炎症小体激活的作用明显减弱,而对NF-κB通路的抑制作用未受明显影响,表明了异甘草素在LPS诱导小鼠ARDS模型中的抗氧化、抗炎活性及保护作用至少部分通过Nrf2介导。结论:综上所述,异甘草素通过上调AMPK/Nrf2/ARE通路、抑制NF-κB通路活化(Nrf2非依赖性)和NLRP3炎症小体激活(Nrf2依赖性)发挥抗氧化和抗炎活性,在LPS诱导的小鼠ARDS模型中起到保护作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563.8
【图文】：
17图1.1 异甘草素的化学结构1.2.2.1 抗炎作用大量实验证据表明，异甘草素在体内外均具有良好的抗炎活性。异甘草素可以在受体水平抑制 LPS 诱导的 TLR4 二聚化，导致 NF-κB 和干扰素调节因子3 活化的抑制，以及多种炎性介质的抑制。在细胞水平，异甘草素通过抑制 IκBα 降解和 NF-κB 核转位，减轻 TNF-α 活化的人脐静脉内皮细胞中血管内皮细胞黏附分子（VCAM）-1和 E-选择素的 mRNA聚集，下调细胞黏附分子蛋白水平，从而干扰了 THP 单核细胞对内皮细胞的黏附；在骨髓来源的树突状细胞中，它能明显抑制 LPS 诱导的 IL-6、IL-12 p40 的增加，它也能够通过抑制 NF-κB p65 和活化蛋白-1（AP-1） 活化减轻 LPS诱导的巨噬细胞的炎症应答
29图2.1 异甘草素显著抑制RAW 264.7细胞中t-BHP诱导的细胞毒性RAW 264.7 细胞经不同浓度异甘草素预处理 18 h 后，给予 t-BHP 刺激 3 h，MTT 法测定细胞存活率。注，采用 mean ± SEM 表示结果，n = 3（独立重复试验次数），与空白组相比，*P < 0.05 和**P < 0.01；与 t-BHP 组相比，#P < 0.05和##P < 0.01。2.3.2 异甘草素显著抑制 t-BHP 诱导的 ROS 产生t-BHP刺激引起的ROS异常产生是氧化应激的重要诱因及标志物，也是引起细胞损伤甚至死亡的主要原因。我们在实验中发现
30图2.2 异甘草素显著抑制RAW 264.7细胞中t-BHP诱导的ROS产生RAW 264.7细胞经不同浓度异甘草素预处理18 h后加入DCFH-DA（终浓度5μM）染色40 min，给予t-BHP刺激5 min。（A）应用酶标仪测定ROS水平。（B）显微镜下观察绿色荧光（放大倍数100倍）测定ROS水平。图中：(a)空白， (b)异甘草素(20 μM)， (c) t-BHP (10 mM)，(d) t-BHP +异甘草素(5 μM)，(e)t-BHP +异甘草素(10 μM)， (f) t-BHP +异甘草素(20 μM)。注，采用mean ± SEM表示结果
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563.8
【图文】：
17图1.1 异甘草素的化学结构1.2.2.1 抗炎作用大量实验证据表明，异甘草素在体内外均具有良好的抗炎活性。异甘草素可以在受体水平抑制 LPS 诱导的 TLR4 二聚化，导致 NF-κB 和干扰素调节因子3 活化的抑制，以及多种炎性介质的抑制。在细胞水平，异甘草素通过抑制 IκBα 降解和 NF-κB 核转位，减轻 TNF-α 活化的人脐静脉内皮细胞中血管内皮细胞黏附分子（VCAM）-1和 E-选择素的 mRNA聚集，下调细胞黏附分子蛋白水平，从而干扰了 THP 单核细胞对内皮细胞的黏附；在骨髓来源的树突状细胞中，它能明显抑制 LPS 诱导的 IL-6、IL-12 p40 的增加，它也能够通过抑制 NF-κB p65 和活化蛋白-1（AP-1） 活化减轻 LPS诱导的巨噬细胞的炎症应答
29图2.1 异甘草素显著抑制RAW 264.7细胞中t-BHP诱导的细胞毒性RAW 264.7 细胞经不同浓度异甘草素预处理 18 h 后，给予 t-BHP 刺激 3 h，MTT 法测定细胞存活率。注，采用 mean ± SEM 表示结果，n = 3（独立重复试验次数），与空白组相比，*P < 0.05 和**P < 0.01；与 t-BHP 组相比，#P < 0.05和##P < 0.01。2.3.2 异甘草素显著抑制 t-BHP 诱导的 ROS 产生t-BHP刺激引起的ROS异常产生是氧化应激的重要诱因及标志物，也是引起细胞损伤甚至死亡的主要原因。我们在实验中发现
30图2.2 异甘草素显著抑制RAW 264.7细胞中t-BHP诱导的ROS产生RAW 264.7细胞经不同浓度异甘草素预处理18 h后加入DCFH-DA（终浓度5μM）染色40 min，给予t-BHP刺激5 min。（A）应用酶标仪测定ROS水平。（B）显微镜下观察绿色荧光（放大倍数100倍）测定ROS水平。图中：(a)空白， (b)异甘草素(20 μM)， (c) t-BHP (10 mM)，(d) t-BHP +异甘草素(5 μM)，(e)t-BHP +异甘草素(10 μM)， (f) t-BHP +异甘草素(20 μM)。注，采用mean ± SEM表示结果
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本文编号：2783263
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