镁黄长石在创面愈合过程中对皮肤再上皮化及重塑的影响
发布时间：2020-08-19 13:19
【摘要】：目的镁黄长石在皮肤组织工程的应用是个全新的方向,目前少数报道可见其在创面修复领域中能起到抗炎、促进内皮细胞增殖和分化的作用,但创面愈合是一个复杂而精密的过程,尤其是在再上皮化及重塑阶段,镁黄长石促进创面愈合的作用机制尚未阐明。本试验旨在观察镁黄长石对表皮干细胞和成纤维细胞增殖、迁移的作用,深入探究生物活性陶瓷—镁黄长石提供的多种阳离子启动与创面愈合相关的信号通路,为镁黄长石在组织工程学的应用上提供一个新方向和实验依据。方法1.选用人表皮干细胞(Human epidermal stem cells,hESCs)系进行体外试验。使用生物活性陶瓷—镁黄长石(Akermanite,Aker)制成浸提液,稀释成为不同浓度,将hESCs放置于中,用CCK-8法筛选出培养hESCs最适宜的浸提液浓度,进一步用免疫荧光(Immunofluorescence,IF)及流式细胞术(Flow CytoMetry,FCM)定量检测三个细胞亚群(G0/G1、S和G2/M)的分布来判定细胞增殖情况;然后用RT-q-PCR法及western blot法检测出hESCs“干性”相关分子Itgβ1、lgr4、lgr5和lgr6等的基因表达,进一步探究浸提液刺激hESCs干性及增殖能力变化的可能机制。另外,通过S cratch法观察浸提液对hESCs的移行能力的影响,采用RT-q-PCR法及western blot法探究与迁移相关的整合素亚基的基因及蛋白的表达。2.提取及培养人成纤维细胞(Human Fibroblasts)进行体外试验。使用镁黄长石制成浸提液,用CCK-8法筛选出培养hESCs的最佳浓度,进一步用FCM法测Aker对成纤维细胞增殖能力的作用;然后采用RT-q-PCR法及western blot法,测出成纤维细胞在Aker处理后,合成出的新的Ⅰ、Ⅲ型胶原的基因、蛋白之表达;另外,通过Scratch法观察Aker对成纤维细胞迁移能力的作用,采用RT-q-PCR法及western blot法探究与迁移能力相关的整合素亚基的基因及蛋白的表达。3.建立BALB/c小鼠烫伤模型,给予Aker粉剂治疗和不治疗处理。观察两组的创面愈合情况。用造模后3、7、14和21天皮肤创面组织,通过HE、IF和Masson染色方法,观察和统计再上皮化、表皮厚度、hESCs干性及胶原沉积的情况。结果1.Aker浸提液对hESCs增殖起到了促进诱导作用,并在不同稀释比例的溶液中其作用表现强弱不同。结果示1/16浓度,其提升细胞活力的作用最为显著。1/16浓度浸提液培养的 hESCs,RT-q-PCR 及 western blot 定量检测,其 Itgβ1、lgr4、lgr5 和 lgr6的mRNA表达上调,Itgβ1蛋白也有提高,提示浸提液增加了 hESCs的干性,致使它的增殖能力变强。同时RT-q-PCR及western blot定量测出Wnt/β-catenin信号通路上有代表性的β-catenin、c-myc、ccnd1的mRNA和蛋白表达都有上调,显示该信号通路被Aker含的活性阳离子激活。另外,划痕法显示1/16浓度组相较于阴性对照组hESCs的迁移能力大大的提高,RT-q-PCR及western blot定量检测结果提示浸提液促进了细胞内的整合素α5β1、α3β1和α6β4上调。2.Aker浸提液也促进诱导成纤维细胞增殖,并在不同稀释比例的溶液中的作用表现强弱不同。此时1/64浓度,其在提高细胞活力和增殖能力最为显著。1/64浓度浸提液处理的成纤维细胞,用RT-q-PCR、western blot定量分析,显示其Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA及蛋白表达均有提高。另外,划痕实验结果显示1/64浓度组相较于阴性对照,成纤维细胞迁移能力增强,RT-q-PCR及western blot定量检测结果提示Aker促进此种细胞的整合素α5β1和α3β1上调。3.小鼠烫伤模型实验,证实Aker粉剂带来促皮肤愈合的效应。HE染色结果显示,Aker粉剂组的再上皮化进程加速,上皮厚度在愈合中期明显厚于对照组,提示Aker粉剂可以有效加强表皮细胞的增殖与分化。IF染色结果显示,在皮肤切片整合素β1表达上,Aker粉剂组要强于对照组,提示该种活性陶瓷可提高表皮细胞的干性。同时,Masson染色的皮肤切片显示,经Aker处理的创面,胶原沉积面积相较要大,排列要整齐,提示镁黄长石对诱导成纤维细胞分泌合成胶原,修复效果要好。结论本研究对生物活性陶瓷--镁黄长石促进皮肤创面愈合的机制进行了初步探索,发现Aker浸提液里包含的钙镁硅三种阳离子能够激活Wnt/β-catenin信号通路,提高表皮细胞的干性,起到促进表皮细胞及成纤维细胞的增殖及迁移的作用,从而加速的再上皮化和胶原的沉积,实现缩短创面愈合时间,扩展了生物活性陶瓷在组织工程领域的应用范围,为创面愈合临床治疗提供新的思路、方向和理论依据。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R641
【图文】：
速度明显提高，与阴性对照组呈现出统计学差异；而其他三个Ａｋｅｉ？组与对照组无明逡逑显差异，第６天时，除１／４浓度Ａｋｅｒ组增殖速度仍最低于阴性对照组外，其他三个逡逑Ａｋｅｒ组皆强于阴性对照组（图１－１）。说明，１／１６浓度Ａｋｅｒ组可以显著提高细胞的增殖逡逑活性。逡逑３．０－，逦丨二１逡逑＾逦＼邋－，１逦ＥＨ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑Ｅ邋２．５－逦ｉ邋．知W 邋１／４逡逑ｉ邋２．0－逦。逦白二逡逑１１－５＿逦“逦Ａ邋１／２５６逡逑５邋１．０－逦Ｓｉｉｔｅ逡逑Ｓ邋＾邋＾邋：邋！＝Ｈ邋：ｌ＝Ｍ逡逑００d剩ⅲ海哄义希卞危插危冲危村危靛危跺澹ǎ模幔╁义贤迹保备髋ǘ龋粒耄澹蚪嵋杭岸哉张嘌裕牛樱茫蠡钚缘挠跋欤停穑迹埃埃担穑迹埃埃埃卞义希玻板义
本文编号：2797136
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R641
【图文】：
速度明显提高，与阴性对照组呈现出统计学差异；而其他三个Ａｋｅｉ？组与对照组无明逡逑显差异，第６天时，除１／４浓度Ａｋｅｒ组增殖速度仍最低于阴性对照组外，其他三个逡逑Ａｋｅｒ组皆强于阴性对照组（图１－１）。说明，１／１６浓度Ａｋｅｒ组可以显著提高细胞的增殖逡逑活性。逡逑３．０－，逦丨二１逡逑＾逦＼邋－，１逦ＥＨ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑Ｅ邋２．５－逦ｉ邋．知W 邋１／４逡逑ｉ邋２．0－逦。逦白二逡逑１１－５＿逦“逦Ａ邋１／２５６逡逑５邋１．０－逦Ｓｉｉｔｅ逡逑Ｓ邋＾邋＾邋：邋！＝Ｈ邋：ｌ＝Ｍ逡逑００d剩ⅲ海哄义希卞危插危冲危村危靛危跺澹ǎ模幔╁义贤迹保备髋ǘ龋粒耄澹蚪嵋杭岸哉张嘌裕牛樱茫蠡钚缘挠跋欤停穑迹埃埃担穑迹埃埃埃卞义希玻板义
本文编号：2797136
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