急性呼吸窘迫综合征的回顾性研究和靶向抑制mTOR对小鼠急性肺损伤的保护作用

发布时间：2020-08-22 06:57

【摘要】：第一部分:急性呼吸窘迫综合征的回顾性研究目的:为了提高对急性呼吸窘迫征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)死亡危险因素和高死亡风险病人的识别,探讨ARDS患者的预后危险因素。并讨论肺内源性、肺外源性ARDS在临床特征和预后上是否存在差异。方法:纳入2014年1月至2018年12月间浙江大学医学院附属第二医院重症医学科收治并诊断为ARDS的患者。收集其一般人口学资料、基础疾病情况、住院情况、实验室指标和生存情况等临床资料,并利用上述资料进行以下评分:查尔森合并症指数(CCI指数)、急性病理生理学和慢性健康评价Ⅱ(APACHE Ⅱ)评分、序贯器官衰竭评价(SOFA)评分。以住院死亡为终点事件分为存活组和死亡组通过多因素Logistics回归分析预后的独立危险因素或保护因素。另外,根据原发病因是否存在直接肺损伤因素分为肺内源性ARDS和肺外源性ARDS,进行亚组分析,对比两者在临床特征和预后上的差异。结果:共计纳入85例符合要求的ARDS患者,其中住院死亡47例(55.3%)。总体患者年龄为60.0(42.5-70.5)岁,60岁及以上老年患者占51.8%。65.9%的患者合并基础疾病史,引入CCI指数对基础疾病情况进行积分评价,总体CCI指数为1.0(0.0-3.0),存活组的CCI指数显著低于死亡组(p0.001)。总体患者的氧合指数(Pa02/Fi02)为 141.0±45.9 mmHg,存活组的 Pa02/FiO2 显著高于死亡组(p0.001)。总体患者APACHE Ⅱ评分为20.3±9.2,存活组的APACHE Ⅱ评分显著低于死亡组(p0.001)。81.2%的患者合并肺外器官衰竭,总体患者SOFA评分为9.1±3.9,肺外器官衰竭数目为2.0(1.0-3.0)个,存活组的SOFA评分、肺外器官衰竭数目均显著低于死亡组(p0.001)。多因素Logistics回归分析得出,Pa02/Fi02是ARDS预后的独立保护因素(OR=0.969,95%CI=(0.952-0.985),p0.001),Pa02/FiO2越高,预后越好;CCI 指数(OR=1.685,95%CI=(1.140-2.492),p=0.009)、剔除了氧合因素的肺外 SOFA 评分(OR=1.511,95%CI=(1.196-1.908),p=0.001)是ARDS预后的独立危险因素,CCI指数越高、肺外SOFA评分越高,预后越差。对比肺内源性和肺外源性ARDS,两者住院死亡率无显著性差异(56.8%vs 53.7%,p=0.470),两者在CCI指数、PaO2/Fi02和APACHE Ⅱ评分上无显著性差异,但肺外源性ARDS组的肺外SOFA评分更高(p0.05)、肺外器官衰竭数目更多(p0.05)。结论:Pa02/FiO2是ARDS预后的独立保护因素,CCI指数和肺外SOFA指数是预后的独立危险因素。肺内源性、外源性ARDS两者的预后无显著差异,肺外源性ARDS更容易合并肺外器官衰竭。.第二部分:靶向抑制mTOR对小鼠急性肺损伤的保护作用目的:构建脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(Acute Lung Inj ury,ALI)小鼠模型,建立经气道滴注靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的小干扰RNA(简称mTOR-siRNA)的给药方法,以探讨mTOR-siRNA对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用。方法:经气道滴注100mg/kg体重的LPS诱导急性肺损伤小鼠模型,观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞和肺组织中炎症相关因子水平等变化,BALF总蛋白水平和肺湿重干重比评价肺水肿程度,肺病理切片和半定量病理评分评价肺组织病理损伤程度。Western Blot、免疫组化和免疫荧光检测LPS诱导ALI模型肺组织中mTOR和下游蛋白p-S6的表达。经气道滴注不同剂量mTOR-siRNA,Western Blot检测肺组织中p-S6表达水平,以评价对mTOR的沉默效果。气道滴注mTOR-siRNA 5mg/kg(相对最佳抑制mTOR表达剂量)预处理,观察在LPS诱导急性肺损伤模型中肺部急性炎症反应、肺水肿程度、肺组织病理损伤程度和生存率的改变。结果:与PBS组相比,经气道滴注100mg/kg体重的LPS 24小时后,小鼠BALF中总有核细胞数目、中性粒细胞数目和中性粒细胞比例均显著升高(p均0.01),肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α MIP-2等炎症相关因子水平显著升高(p均0.05),BALF总蛋白水平和肺湿重干重比显著升高(p均0.05),肺病理示肺泡结构破坏、大量中性粒细胞聚集、肺泡间隔厚度增加和肺泡出血情况,病理损伤评分、肺泡间隔厚度、肺拥挤度显著升高而完整肺泡数显著下降(p均0.001)。在LPS诱导ALI模型小鼠肺组织中,Western Blot示p-mTOR和p-S6表达水平升高,免疫组化和免疫荧光示p-S6表达水平显著增高。Western Blot示5mg/kg mTOR-siRNA(连续4天、每天25μg siRNA/50μl给药方案)能较好降低p-S6的表达,提示有效沉默mTOR,后续试验均以此方案进行。对比con-siRNA+LPS组,mTOR-siRNA显著降低ALI模型小鼠BALF中总有核细胞数目和中性粒细胞数目(p均0.05),肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和MIP-2等炎症相关因子水平显著下降(p均0.01),BALF总蛋白水平和肺干重湿重比显著降低(p均0.05)。HE染色病理示肺组织病理损伤得到缓解,病理损伤评分、肺泡间隔厚度、肺拥挤度均显著下降而完整肺泡数显著上升(p均0.05)。观察LPS给药72小时后的生存情况,mTOR-siRNA+LPS组的生存率稍有提高,但缺乏显著性差异(p=0.406)。结论:LPS诱导急性肺损伤模型肺组织中mTOR和下游蛋白p-S6的活化,气道滴注mTOR-siRNA能缓和LPS诱导ALI模型小鼠肺组织中mTOR活化,显著改善肺部炎症反应、肺水肿程度和肺组织病理损伤程度。尽管对小鼠生存率的改善缺乏显著性差异,但mTOR-siRNA对LPS诱导小鼠急性肺损伤存在一定的保护作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563.8
【图文】：

ｇ邋（ｘ）邋＝邋１．５０５邋＋邋（０．５２２ｘＣＣＩ）邋＋邋（０．４１２ｘ肺夕卜邋ＳＯＦＡ）邋＋邋（－０．０３２＞＜Ｐａ0２／Ｆｉ0２）逡逑为了检验预测模型的效能，绘制预测模型及其纳入的三个因素的受试者工作逡逑曲线（ＲＯＣ曲线）（

实月

表面可见班片样出血。逡逑与ＰＢＳ组相比，ＬＰＳ组小鼠ＢＡＬＦ总有核细胞数、中性粒细胞数均显著升高逡逑（ｐ＜０．０１），巨噬细胞数升高（ｐ＞０．０５），中性粒细胞比例达９０％以上（图２．２）。同逡逑样地，肺组织Ｈ＆Ｅ染色病理切片可见大量中性粒细胞浸润（图２．５）。说明ＬＰＳ诱逡逑导小鼠ＡＬＩ模型中，肺组织出现显著的大量炎症细胞浸润，且以中性粒细胞浸润逡逑为主。逡逑表２．８邋ＬＰＳ诱导小鼠ＡＬＩ模型中ＢＡＬＦ细胞计数逡逑总有核细胞中性粒细胞巨噬细胞数中性粒细胞邋巨噬细胞逡逑数（ｘｌ0６／ｍ｜）数（ｘｌ0６／ｍ｜）邋（ｘｌ0Ｖｍｌ）比例（％）比例（％）逡逑ＰＢＳ邋Ｍ逦３．２邋±０．４逦０．１邋±０．１逦３．０邋±０．４逦４．３邋士邋２．３逦９５．５邋±２．４逡逑ＬＰＳ邋组逦５７．７邋±８．１逦５３．９邋±９．３逦４．４邋±０．６逦９２．７邋±３．２逦９．７邋±邋１．４逡逑（？）逦（ｂ）逦（ｃ）逦（ｄ）逦（ｅ）逡逑＿邋，逦｜逦Ｉ邋＾邋ｎｓ逦＾逦１逡逑Ｉ邋？■逦ｉ邋Ｉ邋－逦丁邋｜邋‘逦，工邋｜册逦＾邋ｉ邋Ｉ逡逑！－逦ｆ－逦ｆ２＿逦！，逦；逦ｌｌ逡逑？邋Ｊ邋—邋，—桯邋３＿＿，逦

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本文编号：2800397