PAR1在内皮细胞凋亡及程序性坏死介导重症中暑急性肺损伤中的作用研究

发布时间：2020-08-22 18:38

【摘要】：研究背景和目的:重症中暑(Heatstroke)是危及人类生命的热相关性疾病,常合并多脏器功能不全。肺损伤是早期高发的并发症之一,主要表现为肺水肿、肺出血及呼吸衰竭。热打击可引起肺微血管内皮细胞(PMVECs)凋亡及程序性坏死,其是介导肺损伤的重要机制。蛋白酶激活受体1(Protease-activated receptor1,PAR1)是一种G蛋白偶联跨膜受体,是凝血酶激活进而导致炎症反应的主要受体。有研究显示,热打击后内皮细胞PAR1显著增加,引起血管内皮细胞通透性升高,从而导致小鼠肺损伤的发生,但其具体机制尚不明确。本研究选用C57BL/6小鼠及PMVECs,研究PAR1与下游信号NF-κB/c-Jun在热打击介导细胞凋亡中的作用及PAR1与下游RIP1/RIP3及MLKL/HMGB1在程序性坏死中的作用。主要方法和结果:1.建立重症中暑小鼠模型,成年雄性C57BL/6小鼠置于39℃、65%湿度的高温仓内,核心体温(Tc)达到42.7℃造模成功,分室温正常对照组(NC);重症中暑组(HS);PAR1抗体预处理中暑组(anti-PAR1);PAR1抑制剂RWJ56110预处理重症中暑组(RWJ+HS)。与HS组比较,使用RWJ56110及PAR1抗体腹腔注射预处理小鼠可明显改善小鼠热耐受力。给予PAR1抑制剂RWJ56110预处理可明显延长重症中暑小鼠生存时间,改善生存率;可降低重症中暑小鼠血清中TNF-α、IL-6及HMGB1水平,减轻全身炎症反应,同时可降低肺泡灌洗液中白细胞计数、中性粒细胞计数、蛋白含量、肺水及干湿重比,从而改善肺损伤。2.PMVECs给予43℃热打击90 min(中度热打击),在恢复温度各时间点(0,2,6,12 h),Hoechst33342染色后,用荧光显微镜观察细胞凋亡情况、Western blotting 检测 Mcl-1、Bax、PAR1 及 c-Jun 表达水平,ELISA 检测 Caspase-3及NF-κB活性,流式细胞仪分析细胞凋亡。结果示随复温时间延长,PMVECs细胞凋亡数目明显增加,Mcl-1、Bax、c-Jun、p-c-Jun表达水平、Caspase-3活性明显增加。给予PAR1 siRNA敲除PAR1及腺病毒过表达PAR1(Ad-PAR1)预处理细胞后,给予相同条件热打击,复温12 h检测相关蛋白表达及细胞凋亡情况,经Ad-PAR1及PAR1激动剂TFLLR-NH2预处理的细胞,Mcl-1明显降低、Bax的表达及Caspase-3活性显著增加,凋亡数目增加;PAR1 siRNA及PAR1抑制剂SCH79797预处理的细胞,Mcl-1明显增加、Bax的表达及Caspase-3活性显著下降,凋亡数目减少,同时还可使NF-κB DNA结合力增强,p-c-Jun和c-Jun的蛋白表达水平显著下降;使用c-Jun siRNA转染细胞,于热打击后复温12 h检测细胞凋亡情况,敲除c-Jun后,细胞凋亡显著减少,c-Jun活化在热打击的PMVECs起着促凋亡作用,我们前期研究结果表明NF-κB活化在热打击的PMVECs中起抗凋亡作用,综上所述,PAR1通过抑制NF-κB活化及增强c-Jun活化起着促凋亡作用。3.建立重症中暑小鼠模型,复温2 h,ELISA方法检测肺泡灌洗液中HMGB1及RIP3水平。与对照组比较,给予PAR1抑制剂RWJ56110处理的小鼠,肺泡灌洗液中HMGB1及RIP3水平降低;肺组织中RIP1/RIP3复合物的形成减少。PMVECs给予43℃热打击3 h(重度热打击),恢复期各个时间点(0,2,6,12 h)检测到RIP1及MLKL蛋白表达水平显著升高;恢复期6 h,坏死小体(RIP1/RIP3 复合物)形成;RIP1 抑制剂 Nec-1、RIP1siRNA、RIP3siRNA 及两者联合预处理可抑制PMVECs发生程序性坏死;给予PAR1抑制剂预处理,减轻热打击导致的HMGB1移位,减少细胞程序性坏死。结论PAR1可能通过抑制NF-κB活化及激活c-Jun促进热打击PMVECs凋亡,并通过促进RIP1/RIP3复合物形成导致PMVECs程序性坏死,从而引起重症中暑急性肺损伤。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R594.12;R563
【图文】：

程序性,炎症性肠病,缺血再灌注损伤,动脉粥样硬化

图１－２程序性坏死细胞信号通路图逡逑ＦＩＧ．邋１－２邋Ｓｉｇｎａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ｎｅｃｒｏｐｔｏｓｉｓ邋ｃｅｌｌｓ．逡逑程序性坏死在心肌梗死、动脉粥样硬化，缺血再灌注损伤和炎症性肠病中起逡逑重要的病理生理作用。近年来研究报道，程序性坏死在包括慢性阻塞性肺病逡逑（ＣＯＰＤ）、肺癌、急性肺损伤、感染和脓毒症的发病机制中起重要作用［６９］。目逡逑前，坏死性凋亡被定义为ＲＩＰ３依赖性坏死性细胞死亡，将ＲＩＰＫ３敲除可完全缓逡逑

小鼠,生存率,预处理

逡逑条件下饲养，计算７２邋ｈ生存率。由图２－７所示，经ＲＷＪ５６１１０预处理的小鼠重症逡逑中暑后死亡率明显下降。逡逑１５０ｎ逡逑ＨＳ逡逑－逦ＨＳ＋ＲＷＪ逡逑！邋１０0１逡逑的逦１逡逑０逦１逦１逡逑ｅ邋５0－邋ｈ逡逑１逦１逦■逡逑０逦１０００逦２０００逦３０００逦４０００逦５０００逡逑Ｔｉｍｅ逡逑图２－２邋ＲＷＪ５６１１０预处理对重症中暑小鼠生存率的影响。ＨＳ＋ＲＷＪ为重症中暑前给ＲＷＪ５６１１０逡逑组，ＨＳ为重症中暑组。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－２．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＲＷＪ５６１１０邋ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｏｎ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ｓｅｖｅｒｅ邋ｈｅａｔｓｔｒｏｋｅ邋ｍｉｃｅ．逡逑ＨＳ＋ＲＷＪ邋ｗａｓ邋ｇｉｖｅｎ邋ＲＷＪ５６１１０邋ｇｒｏｕｐ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ｓｅｖｅｒｅ邋ｈｅａｔ邋ｓｔｒｏｋｅ．邋ＨＳ邋ｉｓ邋ｓｅｖｅｒｅ邋ｈｅａｔ邋ｓｔｒｏｋｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑１．５邋ＲＷＪ５６１１０预处理可降低重症中暑小鼠血清中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－６及逡逑ＨＭＧＢ１水平。逡逑建立重症中暑动物模型，重症中暑组小鼠分为对照中暑组（ＨＳ），及给予腹逡逑腔注射ＲＷＪ５６１１０预处理的中暑组（ＲＷＪ＋ＨＳ），达到重症中暑条件后置于室温逡逑条件下饲养，于恢复期不同时间点处于小鼠心脏采血，检测ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－６及逡逑ＨＭＧＢ１水平，如图２－３所示，小鼠发生重症中暑后ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－６及ＨＭＧＢ１水逡逑平Ｏｈ即发生明显升高，２邋ｈ达到高峰，后逐渐恢复到较低水平，但仍较基础水逡逑平升高，小鼠经ＲＷＪ５６１１０预处理后ＴＮＦ－ｏｕ邋ＩＬ－６及ＨＭＧＢ１水平较ＨＳ均存在逡逑不同程度的降低

小鼠,预处理,生存率,重症

【参考文献】