磷脂酰肌醇3激酶信号通路在天麻素抑制脂多糖诱导H9c2心肌细胞炎症反应中的保护性机制研究

发布时间：2020-10-02 07:55

　　 [目的]通过构建脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的大鼠H9c2心肌细胞为炎症模型,从细胞和分子层面探讨天麻素对H9c2心肌细胞炎症的抑制作用及其信号机制。 [方法]体外培养的大鼠H9c2心肌细胞随机分为空白对照组、LPS (1μg/ml,30min-12h)处理组、不同浓度的天麻素(5、10和20μM,1h)+LPS处理组、不同浓度的天麻素+LPS+wortmannin (1μM)共同处理组和阳性对照组。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测天麻素、LPS以及wortmannin对H9C2心肌细胞的活力影响；采用免疫荧光双标记检测方法(double-immunofluorescence labeling assay)在荧光显微镜下观察细胞内诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)和白介素-6(interleukin-6, IL-6)蛋白水平的变化；应用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的mRNA水平的变化；采用蛋白质印迹分析方法(western blotting)检测蛋白激酶B (protein kinase B, Akt)、抑制剂κB (inhibitor κB,IκB)、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)、 c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)和p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinases, p38MAPK)等细胞信号通路蛋白的表达及其变化规律：采用凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)检测核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)的蛋白表达水平。 [结果]H9c2心肌细胞以1×106个/ml浓度接种于6孔板中,当密度均匀生长至80%时,使用MTT检测H9c2心肌细胞活力影响,结果显示：经天麻素(5、10和20μM)、 LPS (1μg/ml)和wortmannin (1μM)分别处理或共同处理12h后该细胞活性均无明显影响；加入P13-K抑制剂wortmannin (1μM)1h后,再加入天麻素和LPS处理细胞30min-3h,采用免疫荧光双标记检测方法、RT-PCR、 EMSA以及western blotting分析,得到结果：①不同浓度的天麻素明显激活H9c2心肌细胞PI3-K/Akt的磷酸化表达；②不同浓度的天麻素通过PI3-K/Akt信号通路在转录水平和翻译水平明显抑制LPS诱导的H9c2心肌细胞促炎性蛋白酶iNOS和COX-2的表达；③不同浓度的天麻素激活PI3-K/Akt信号通路下调LPS诱导的H9C2心肌细胞促炎性细胞因子TNF-a和IL-6在mRNA水平和蛋白水平的表达；④天麻素通过PI3-K/Akt信号通路抑制LPS诱导的H9c2心肌细胞NF-κB的激活；⑤天麻素激活PI3-K/Akt信号通路抑制LPS诱导的H9c2心肌细胞IκB、 ERK1/2、 JNK和p38MAPK的磷酸化。 [结论]①5-20gM的天麻素、1μg/ml的LPS和1μM wortmannin的对细胞活性没有影响；②天麻素通过PI3-K/Akt信号通路抑制MAPKs的磷酸化来调控LPS诱导的H9c2心肌细胞内促炎性蛋白酶以及促炎性细胞因子的释放;③天麻素激活PI3-K/Akt信号通路抑制IκB的磷酸化和NF-κB的活化,从而发挥天麻素下调LPS诱导的H9c2心肌细胞的抗炎作用。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R459.7
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本文编号：2832133