背景和目的蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)是临床最常见的脑血管危急重症之一,主要为颅内动脉瘤破裂所致。随着神经影像和显微手术的进步,动脉瘤破裂出血造成的直接死亡率明显下降,但患者预后不佳,接近50%的幸存者伴有肢体瘫痪、情感或记忆障碍、丧失重新工作和生活自理能力。因此,针对SAH后继发脑损伤的防治变得愈发重要,成为降低致死致残率和改善患者预后的重要因素和研究热点。SAH后继发性脑损伤的机制至今尚未完全阐述清楚。既往研究均着眼于SAH后大血管痉挛上,认为颅内大动脉痉挛是SAH后最严重的并发症。该认识来源于SAH患者的脑血管造影显示其存在颅内大动脉(大于200μm)的缩窄,而SAH患者又会同时出现无法解释的缺血性神经损伤样症状。因此,血管一直以来被认为是引起SAH患者死亡或致残的主要原因。然而,近年来其与SAH后继发性神经功能障碍的关系备受质疑。一项应用选择性内皮素A受体拮抗剂Clazosentan来治疗SAH患者的多中心、随机、安慰剂对照、双盲的临床研究结果显示:Clazosentan能够显著逆转脑血管造影所示的血管痉挛,但并不能改善SAH患者的神经功能预后。事实上,在颅内动脉瘤破裂引起SAH的同时,继发性脑损伤就已经开始发生了。动脉瘤破裂的瞬间,颅内压极速升高,甚至达到与动脉收缩压相同的程度。因此,SAH患者最常见的主诉是“一生中从未有过的剧烈头痛”。动物实验证实,SAH后10分钟内,兴奋性氨基酸释放、神经元凋亡、细胞坏死等病理生理过程已被激活。基于上述临床和实验研究结果,美国John H.Zhang教授将发生在SAH后最初72小时内的脑损伤定义为早期脑损伤(Early Brain Injury,EBI),认为早期脑损伤是影响SAH患者急性期死亡和幸存者后期神经功能缺损的重要因素,也是影响迟发性血管痉挛的重要因素,对早期脑损伤进行干预可明显提高患者生存率和预后。然而,近年来单纯针对神经元进行保护的临床试验均告失败,促使大家在继续研究SAH后神经元损伤的同时,愈加重视颅内各种细胞之间的广泛联系——血管神经网络(vascularneuralnetwork)。该结构包括:内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞、神经元以及与之直接相关的毛细血管、血管平滑肌细胞、血管内皮与管周神经纤维联系、颅内微循环及其上下游小动静脉。由于该结构中各种细胞之间存在简单、快速的交流影响机制,所以保护该网络中的其他结构与保护神经元同样重要。血脑屏障(bloodbrainbarrier,bbb)是该网络中最具代表性的神经血管单元(neurovascularunit),主要由内皮细胞及其紧密连接、星形胶质细胞、血管周围的小胶质细胞、基膜、以及周细胞等组成,最终构成一个调节中枢神经系统内环境稳态的细胞屏障,维持脑组织内离子、激素和递质的动态平衡,保护中枢神经系统不受损伤。临床上,sah早期即可产生广泛的全脑水肿,与血脑屏障损伤导致的血管源性水肿密切相关,是导致sah患者早期脑损伤和不良预后的主要因素之一。既往研究证实,血管神经网络中毋庸置疑的存在着血脑屏障自我修复机制;因此,针对sah早期血脑屏障损伤的修复,可能成为未来sah等多种急性神经损伤疾病的可靠治疗靶点。因此,本研究拟在前期工作基础上,针对sah后血管神经网络的关键靶点:神经元和血脑屏障,分别进行干预,探讨sah后早期脑损伤的内在病理生理机制,为临床转化奠定基础。此外,本研究拟进一步探索颅内微循环下游静脉系统在sah后早期脑损伤发生发展中的作用,丰富早期脑损伤理论,为临床sah患者救治提供可靠的新思路。材料与方法1、采用大脑中动脉线穿法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型。2、采用bpv(pic)(0.2mg/kg)对sah模型大鼠进行干预,进而评价其神经功能障碍、脑含水量、伊文氏蓝渗出量、海马神经元死亡情况、以及谷氨酸ampa受体亚基变化。3、在sah术前48小时侧脑室注射frizzled4sirna,sah术后3小时侧脑室注射重组norrin蛋白,进而评价sah出血量、神经功能障碍、脑含水量、伊文氏蓝渗出量,并用westernblot和免疫荧光染色检测norrin及其受体、以及调节蛋白tspan12在调控血脑屏障连接蛋白中的分子作用机制。4、利用脑组织体积、脑组织内血液含量等指标评价sah后大脑血液循环淤积情况,并在sah模型的基础上,观察皮层引流静脉和颈内静脉回流障碍对sah后脑组织的影响。结果1、在sah后,作为pten活性标志的pten-ser380去磷酸化水平,能够被bpv(pic)疗法显著抑制;同时,pten蛋白表达水平较sah+vehicle组亦显著下降。我们同时发现bpv(pic)疗法能够显著改善神经功能预后,对sah后早期脑损伤的各种急性病例改变起保护作用,包括血脑屏障破坏、脑水肿、神经元死亡等。这些神经保护作用于谷氨酸ampa受体亚基调控相关。具体来说,bpv(pic)治疗后细胞膜上谷氨酸glur1亚基蛋白表达下降,谷氨酸glur2亚基和谷氨酸glur3亚基蛋白表达水平升高。这些结果显示:bpv(pic)通过抑制pten对sah后早期脑损伤起到了保护作用。2、sah后内源性norrin蛋白在脑组织中显著增高,波峰分别在sah后12小时及72小时。同时,norrin蛋白发挥作用的一个支持蛋白tspan12也在sah后显著增高,并持续到sah后72小时。重组norrin蛋白能够显著改善sah后神经功能缺损和血脑屏障的破坏,这些神经保护作用与其促进β-catenin从细胞质转移进入细胞核,以及上调occludin,ve-cadherin和zo-1蛋白表达水平有关。进一步研究发现,用小干扰rna抑制其受体frizzled4受体可以逆转重组norrin蛋白疗法的这些保护作用;表现为阻碍β-catenin向细胞核转位并降低occludin,ve-cadherin和zo-1蛋白表达水平。综合分析后我们认为norrin对于sah后血脑屏障损伤起到了保护作用。3、在sah后24小时,血管破裂同侧大脑半球(左侧半球)较右侧大脑半球显著肿胀,且左侧大脑半球内血液含量较假手术组显著升高,而右侧大脑半球与假手术组没有统计学差异。进一步分析显示:左侧大脑半球含血量与肿胀比例呈正相关关系,与大鼠改良garcia神经功能评分呈负相关关系,但与sah出血量评分无直接相关关系。皮层引流静脉阻断后,sah模型大鼠对应引流皮层局部发生明显充血肿胀,而颈内静脉结扎后可见静脉引流区域微小静脉较sah组显著怒张。结论1、bpv(pic)疗法能够减轻sah后早期脑损伤程度,该作用是通过抑制pten进而调控谷氨酸ampa亚基所发挥的。基于bpv(pic)疗法在低浓度下具有高选择性和高效性,能够显著避免毒副作用,它可能会成为治疗sah患者早期脑损伤的一个可靠治疗方法。2、sah后脑组织中内源性norrin蛋白显著增高;外源性重组norrin疗法能够保护血脑屏障完整性并改善神经功能预后,其机制可能与frizzled4受体介导的β-catenin核转位并进一步增强内皮细胞间隙蛋白表达有关。因此,重组Norrin疗法有可能成为改善SAH患者血脑屏障功能的可靠的新选择。3、SAH后脑组织存在循环血流量淤积,损伤同侧大脑半球更为显著;颈部大静脉和皮层引流小静脉回流障碍会加重SAH后脑组织肿胀,进而加重早期脑损伤和神经功能预后。因此,恢复SAH后动静脉系统平衡,对于缓解早期脑损伤至关重要。4、血管神经网络对于维持脑组织稳态起到了关键的作用,SAH后针对血管神经网络的病理生理改变进行针对性保护,可以显著减轻早期脑损伤,并最终改善患者预后。基于血管神经网络进行临床转化医学研究可能对于SAH患者的临床救治提供可靠的新治疗方案。
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R651.15
【文章目录】：缩略语表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 抑癌基因PTEN在SAH后神经元损伤中的作用及机制
2.1 研究背景
2.2 材料与方法
2.3 结果
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 Norrin蛋白在SAH后血脑屏障损伤修复中的作用及机制
3.1 研究背景
3.2 材料与方法
3.3 结果
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 颅内静脉系统在SAH后早期脑损伤发生发展中的作用
4.1 研究背景
4.2 材料与方法
4.3 结果
4.4 讨论
4.5 小结
全文总结
参考文献
文献综述一 静脉系统在急性脑损伤中的作用及病理生理机制
参考文献
文献综述二 周细胞在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用
参考文献
攻读学位期间的研究成果
致谢
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2839311
