血必净注射液对脓毒症小鼠腹腔巨噬细胞的影响

发布时间：2020-10-13 11:59

　　 研究目的： (1)观察血必净注射液对内毒素(Lipopolysaccharide, LPS)刺激下巨噬细胞增殖及吞噬功能的影响。 (2)观察血必净注射液对脓毒症巨噬细胞分化的影响,并探索其发挥作用可能的信号通路。 研究方法： (1)分离提纯小鼠腹腔巨噬细胞后,以1×106/ml密度种板。生长2h后,加入血必净注射液(Omg/ml,1mg/ml,5mg/ml,10mg/ml,50mg/ml,100mg/ml)孵育1h,再加入LPS (100ng/ml)刺激： 分别于12h,24h,48h加入细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)试剂,孵育2h后,酶标仪检测450nnm处的吸光值(OD450nm); 孵育24h后,更换混有荧光微球的培养基(1：100),培养2h后,磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS)清洗未被吞噬的荧光微球,免疫荧光显微镜观察照相或用胰酶消化后上流式直接检测。 (2)分离提纯小鼠腹腔巨噬细胞后,以1×106/ml密度种板,生长2h后,加入血必净注射液(Omg/ml,1mg/ml，5mg/ml,10mg/ml,50mg/ml,100mg/ml)孵育1h,再加入LPS (100ng/ml)刺激： 分别在6h,12h,24h收集上清,酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)检测肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)-α,白介素(Interleukin, IL)-6, IL-10;收集细胞进行流式检测F4/80+CD11c+CD206-及F4/80+CD11c-CD206+细胞比例； 分别在0h,0.5h,2h,6h,24h固定细胞,使用活细胞ELISA方法检测Janus激酶(Janus Kinase)1-信号传导及转录激活因子(Signal Transducers and Activators of Transcription, STAT)6总量及其磷酸化的比例。 (3)分离提纯小鼠腹腔巨噬细胞后,以1×106/ml密度种板,分别给予JAK1及STAT6抑制剂干预2h后,再加入血必净注射液(5mg/ml)培养1h,而后给予LPS (100ng/ml)刺激,24h后收集上清ELISA法检测TNF-α,IL-6, IL-10;收集细胞流式检测F4/80+CD100c+CD206-及F4/80+CD100c-CD206+细胞比例。 (4)制备小鼠盲肠结扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture, CLP)模型,实验组给予血必净注射液,对照组给予PBS,分别于术后0.5h,12h,24h,36h,48h,60h,72h,84h,96h进行肌肉注射： 术后12h,24h,48h,60h,72h,84h,96h,120h计数存活小鼠,Kaplan-Merer法进行生存率分析； 术后6h,24h,48h处死小鼠留取外周血血清检测]TNF-α, IL-6,IL-10;灌洗腹腔巨噬细胞流式检测F4/80+CD11c+CD206-及F4/80+CD11c-CD206+细胞比例。 结果： (1)在一定剂量(5mg/ml)的血必净注射液干预下,LPS刺激下巨噬细胞增殖明显,而高于10mg/ml的剂量则会产生明显的抑制作用,在时间上则以48h时间点最为显著；在5mg/ml及10mg/ml剂量的血必净注射液干预下,LPS刺激后巨噬细胞的吞噬功能增强,而在50mg/ml和100mg/ml剂量下则产生抑制作用。 (2)在中等剂量(5mg/ml)的血必净注射液干预下,LPS刺激后小鼠腹腔巨噬细胞由M1型向M2型分化,且以刺激24h最为明显；当剂量高于10mg/ml时,这种促进作用减弱。 (3)中等剂量(5mg/ml)的血必净注射液在2h时间点下,JAK1-STAT6磷酸化增强；给予JAK1以及STAT6特异性抑制剂后,促M2型分化的效应减弱。 (4)血必净注射液干预组小鼠外周血血清M1型相关细胞因子(TNF-α、 IL-6)较对照组明显降低,而M2相关的细胞因子(IL-10)较对照组升高；灌洗小鼠腹腔巨噬细胞中M2型巨噬细胞比例增加；小鼠生存率提高。 结论： (1)中等剂量(5mg/ml)的血必净注射液可以促进LPS刺激下小鼠腹腔巨噬细胞的增殖,并增强其吞噬功能；而在高于10mg/ml的剂量下则会产生抑制作用。 (2)中等剂量(5mg/ml)的血必净注射液可以促进LPS刺激下小鼠腹腔巨噬细胞由M1向M2分化,而在高于10mg/ml剂量下这种促进作用减弱；其作用的分子机制与JAK1-STAT6通路有关。 (3)血必净注射液可以提高脓毒症小鼠的生存率,且与其促进小鼠巨噬细胞的分化有关。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R459.7
【部分图文】：

10 50 100 mg/mi图1-1流式细胞术检测不同剂量下血必净注射液对小鼠腹腔巨嗟细胞吞喷功能的影响XBJ Omg/ml XBJ 1mg/m丨 XBJ 5mg/ml盡盡盡■ ■■XBJ 10mg/ml XBJ 50mg/m丨 XBJ 100mg/ml图1-2免疫焚光显微镜观察不同剂量下血必净注射液对小鼠腹腔巨隨细胞吞嗟功能的影响1.3讨论当机体遭受外界病原入侵时，组织原位巨唾细胞（local macrophages)首当其冲，它通过识别、吞唾、抗原提呈等作用杀灭病原菌，释放趋化因子（CXCL9、7
【参考文献】

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1 姚咏明,盛志勇;脓毒症信号转导机制的现代认识[J];中国危重病急救医学;2003年01期

本文编号：2839140