己糖激酶Ⅱ在缺氧小鼠心肌细胞自噬流受损中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-16 01:32

　　 研究背景:严重烧伤、创伤、高原低氧环境以及其它原因引起的心脏缺氧,都可导致心肌损害。如严重烧伤后,由于强烈的应激和有效循环血容量减少,心肌可因局部血流灌注不足而发生缺氧。心脏作为高耗能循环动力器官,心肌易受缺氧影响而出现严重损伤,并最终诱发或加重烧伤休克,增加严重烧伤病死率。因此,心肌缺氧损害已成为临床救治严重烧伤、创伤等病人不可忽视的问题,阐明缺氧导致的心肌细胞损害及其发生机制具有重要的临床意义。自噬是进化上保守且依赖于溶酶体系统的细胞内降解途径,在生理条件下,自噬通过降解细胞内的长寿命蛋白和老化受损细胞器来维持细胞的正常功能。然而,当自噬过程即自噬流受损时,细胞会因降解底物堆积和营养供给障碍而死亡。近期研究显示,自噬流受损是多种病理因素导致细胞功能障碍甚至死亡的重要途径。因此,严重烧伤、创伤等引起的缺氧可能通过损伤自噬流导致心肌细胞损害,但其具体作用及机制目前尚不清楚。己糖激酶是糖酵解第一步反应的限速酶,在哺乳动物中,己糖激酶以四种亚型存在于不同组织细胞,在心肌细胞中主要是己糖激酶Ⅱ。研究显示,缺氧可上调己糖激酶Ⅱ的表达水平,并导致小鼠神经细胞损伤。另有研究显示,在无糖饥饿时,己糖激酶Ⅱ参与大鼠心肌细胞自噬的调控。因此,我们推测,己糖激酶Ⅱ可能介导了缺氧导致的心肌细胞自噬流受损。MTORC1是细胞生长和代谢的关键调节因子。在饥饿条件下,其活性可迅速被抑制从而引发自噬,随后其活性又被自噬产生的营养物质再次激活从而终止自噬。因而,MTORC1是调节自噬的重要“开关”。然而,缺氧条件下,己糖激酶Ⅱ是否通过MTORC1调控心肌细胞自噬流,目前尚无相关报道。因此,本研究提出缺氧条件下己糖激酶Ⅱ通过MTORC1损伤自噬流进而导致心肌细胞损伤的假设,通过体外构建缺氧模型以及调控己糖激酶Ⅱ的活性和表达,明确己糖激酶Ⅱ在缺氧导致小鼠心肌细胞自噬流受损中的作用及其机制。研究方法:取6只1~2 d龄雌雄不限C57BL/6小鼠,分离心脏并培养原代心肌细胞,并取原代细胞进行以下实验:1.将细胞随机分为6组,即正常对照3、6、9 h组及缺氧3、6、9 h组。DMEM-F12培养基常规培养48 h后,各正常对照组更换新鲜DMEM-F12培养基后分别培养3、6、9 h,各缺氧组更换无糖无血清培养基后于37℃低氧培养箱(1%氧气、5%二氧化碳)内分别培养3、6、9 h。蛋白质印迹法检测LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ的表达情况,CCK-8法检测细胞活力。2.将细胞随机分为正常对照组、单纯缺氧9 h组和缺氧9 h+2-DG组。常规培养48h后,正常对照组更换新鲜DMEM-F12培养基后培养9 h,单纯缺氧9 h组更换无糖无血清培养基,缺氧9 h+2-DG组更换溶有2-DG(物质的量浓度为10 mmol/L)的无糖无血清培养基,2组均缺氧培养9 h。蛋白质印迹法检测LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62的表达情况,透射电镜法观察细胞自噬体/自噬溶酶体情况,CCK-8法检测细胞活力。3.将细胞随机分为正常对照组、单纯缺氧9 h组、缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组。正常对照组和单纯缺氧9 h组常规培养48 h,其余两组分别转染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常规培养48 h。正常对照组更换新鲜DMEM-F12培养基后培养9 h,其余三组更换无糖无血清培养基后缺氧培养9 h。蛋白质印迹法检测LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ的表达情况,CCK-8法检测细胞活力。4.细胞分组及处理同方法1,蛋白质印迹法检测反映MTORC1活性的磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表达情况;细胞分组及处理同方法2,蛋白质印迹法检测磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表达情况;细胞分组及处理同方法3,蛋白质印迹法检测磷酸化的p70S6K和4E-BP1的表达情况。结果:1.与对应正常对照3、6、9 h组比较,缺氧3、6、9 h组细胞反映自噬流是否通畅的指标LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62表达水平均显著增加,细胞活力显著降低,己糖激酶Ⅱ表达水平显著增加。2.与正常对照组比较,单纯缺氧9 h组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62表达水平明显增加,自噬体/自噬溶酶体堆积,细胞活力明显降低;与单纯缺氧9 h组比较,缺氧9 h+2-DG组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62表达水平明显减少,自噬体/自噬溶酶体堆积情况明显改善,细胞活力明显增加。3.与正常对照组比较,单纯缺氧9 h组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值与p62、己糖激酶Ⅱ表达水平均显著增加,细胞活力显著降低;与单纯缺氧9 h组比较,缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值与p62、己糖激酶Ⅱ表达水平均显著减少,细胞活力显著增加。4.与对应正常对照组比较,缺氧各组细胞磷酸化的p70S6K和4E-BP1表达水平明显降低;与单纯缺氧9 h组相比,缺氧9 h+2-DG组细胞磷酸化的p70S6K和4E-BP1表达水平明显增加;与单纯缺氧9 h组相比,缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组细胞磷酸化的p70S6K和4E-BP1表达水平明显增加。结论:缺氧后,心肌细胞己糖激酶Ⅱ表达增加,通过抑制MTORC1的活性,引起自噬流受损,最终导致心肌细胞活力下降。抑制己糖激酶Ⅱ的活性或其表达可减轻心肌细胞缺氧损害。该结论为临床防治严重烧伤后缺氧导致的心肌细胞损害提供了新思路,也为创伤、高原低氧环境以及其他原因引起的心肌缺氧损害防治提供了参考。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R644
【部分图文】：

陆军军医大学硕士学位论文个指标来判断自噬流是否通畅[30]。结果显示，与对应正常对照 3、6、9 h 组比较， 3、6、9 h 组心肌细胞 LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著增加（n=3； P<0.01），p62 表达水平显著（n=3；P<0.01），提示缺氧可导致心肌细胞自噬流受损（图 2-1，A，B 和 C）。

图 2-1 缺氧对小鼠心肌细胞自噬流的影响 3 h 组，2. 缺氧 3 h 组，3. 正常对照 6 h 组，4. 缺氧 6 小鼠心肌细胞活力的影响表法将原代小鼠心肌细胞分为 6 组，即正常对照 3过 CCK-8 法对各组细胞的活力进行检测。结果显示，缺氧 3、6、9 h 组心肌细胞活力均有不同程度下降肌细胞活力下降（图 2-2）。

陆军军医大学硕士学位论文组及缺氧 3、6、9 h 组。通过蛋白质印迹法检测各组心肌细胞己糖激酶Ⅱ的表达情况。结果显示，与对应正常对照 3、6、9 h 组比较，缺氧 3、6、9 h 组心肌细胞己糖激酶Ⅱ的表达水平明显增加（n=3；P<0.01），提示缺氧可上调小鼠心肌细胞己糖激酶Ⅱ的表达水平（图 2-3，A 和 B）。
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本文编号：2842544