丹参酮IIA磺酸钠抑制热应激诱导的血管内皮细胞凋亡的机制研究

发布时间：2020-10-21 12:24

　　 目的:热射病(heatstroke,HS)是一种危及生命的疾病,热应激时在各类细胞因子和炎症因子的共同作用下,内皮细胞(endothelial cell)早期即可被激活且功能受损,而损伤的内皮细胞可进一步加重炎症反应,最终导致多器官功能衰竭的发生。丹参酮IIA磺酸钠(TanshinoneIIA sulfonate,STS)在血管内皮保护中具有许多作用。目前研究表明,STS能够抑制人脐静脉内皮细胞凋亡,并减轻高温引起的大鼠体内的炎症反应。因此,探讨STS治疗对热打击的内皮细胞的影响对于防治中暑及阐明高热对内皮细胞的损伤机制具有重要的理论与实践意义。综上,本研究旨在阐释丹参酮IIA磺酸钠(TanshinoneIIA sulfonate,STS)治疗对热打击内皮细胞的影响以及细胞对STS治疗的反应机制。方法:1.CCK-8法检测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞在42℃暴露不同时长的细胞活性,Annexin V/PI流式细胞术检测热诱导不同时长对HUVEC细胞凋亡率的影响,Western-blotting检测热诱导后HUVEC细胞中凋亡相关分子变化,探讨热诱导对HUVEC细胞凋亡水平的影响。2.HUVEC细胞在STS不同浓度作用下细胞活性改变,及热诱导后恢复不同的时长HUVEC细胞的活性改变,以此筛选STS的作用浓度,和热诱导后的恢复时间。3.CCK-8法检测HUVEC细胞在STS作用下细胞活性的变化,Annexin V/PI流式细胞术检测STS对热诱导的HUVEC细胞凋亡率的影响,利用caspase活性检测试剂盒检测凋亡效应酶Caspase-3的活性。探讨STS在热诱导的环境中对HUVEC细胞的保护作用。4.探讨STS对热诱导引起HUVEC细胞凋亡影响的机制。硝酸盐/亚硝酸盐比色分析法检测STS对热诱导不同时长HUVEC细胞中亚硝酸盐产量的影响,western blot检测不同时间点eNOS的磷酸化水平,利用eNOS的抑制剂L-NMMA阻断eNOS的磷酸化,检测STS对阻断eNOS后HUVEC细胞中eNOS磷酸化的影响、STS对高温引起的HUVEC细胞活性及细胞凋亡率的影响。初步探讨NO与热诱导引起的HUVEC细胞凋亡的相关性。5.探讨热诱导的HUVEC细胞中eNOS的磷酸化是否由Akt的磷酸化而调节。利用western blot检测STS对热诱导不同时间点HUVEC细胞中Akt磷酸化情况的影响,STS对阻断Akt磷酸化后HUVEC细胞中eNOS的影响,利用了Akt的抑制剂MK-2206后,利用western blot检测STS对热诱导不同时间点HUVEC细胞中Akt磷酸化情况。6.探索STS诱导的Akt磷酸化或eNOS磷酸化是否通过PI3激酶依赖的调控机制所控制。利用PI3K抑制剂Wortmannin,western blot检测高温环境下STS引起的HUVEC细胞中磷酸化的Akt及磷酸化的eNOS的变化。抑制剂MK-2206、Wortmannin对热诱导下HUVEC细胞凋亡的影响。结果:1.HUVEC细胞在42℃暴露不同时长细胞活性随时间延长而降低,热诱导不同时长HUVEC细胞凋亡率随时间延长而增高,热诱导后HUVEC细胞中cleaved-caspase-3随时间延长而蛋白表达水平增高。2.STS作用浓度为2μg/ml时,热诱导后的HUVEC细胞活性有明显改善;在恢复2小时时STS的保护作用已显现;当恢复时间越来越长,细胞在无药物作用下活性也会有一定程度的回升,且即使STS作用浓度非常低(0.002μg/ml)也能有保护细胞的作用。3.在暴露于42℃中1小时后,可以观察到在热诱导后细胞有变圆和脱落的现象,而用STS(2μg/ml)处理后这种现象有了明显的减轻。从细胞活性检测的情况看,在暴露于42℃中1小时后,可以观察到在热诱导后细胞活性降低,而用STS(2μg/ml)处理后细胞活性有了一定程度的回升。在用STS(2μg/ml)处理后再将细胞暴露于42℃中1小时,相对于STS未处理的热诱导组细胞,STS处理后使热诱导的HUVEC细胞凋亡率明显减少,结果具有显著的统计学差异。热诱导的HUVEC细胞在STS作用后,凋亡效应酶Caspase-3的活性降低。探讨STS在热诱导的环境中对HUVEC细胞的保护作用。4.在没有STS处理时,热诱导下HUVEC细胞的亚硝酸盐生成量在0.5小时显著增加,1和2小时急剧下降,亚硝酸盐产量在2小时处于基线水平。而经STS(2μg/ml)处理的HUVEC细胞,在热诱导后细胞中亚硝酸盐的生产逐渐增加,在1小时达到稳定状态,显著高于同时期未用STS处理的HUVEC细胞中亚硝酸盐的水平。HUVEC细胞中的eNOS蛋白磷酸化水平在热诱导后15分钟和30分钟时有所增加,在1小时和2小时时eNOS的磷酸化又有所降低,经过STS(2μg/ml)处理后,HUVEC细胞中eNOS磷酸化从热诱导后15分钟到1小时呈持续增加。在L-NMMA预处理后,即使有STS的作用,HUVEC细胞在热诱导后,eNOS的磷酸化水平无明显改变。此外,L-NMMA的预处理使高温引起的HUVEC细胞活性减弱,在STS作用后情况并无改观。同样,L-NMMA的预处理使高温引起的HUVEC细胞cleaved-caspase-3表达增多,STS作用对这个情况也无改观。5.在没有STS处理的情况下,和热诱导1小时和2小时相比,在热诱导15分钟和30分钟时HUVEC细胞中磷酸化Akt水平增高。然而,如果经STS(2μg/ml)作用后,Akt磷酸化随时间的延长持续增加,在1小时时趋于稳定。MK-2206预处理后,热诱导的HUVEC细胞在MK-2206预处理后可以抑制STS诱导的eNOS磷酸化增强,同样,MK-2206预处理可显著抑制STS对高温下HUVEC细胞中亚硝酸盐产量的影响。6.Wortmannin抑制了高温环境下STS引起的HUVEC细胞中eNOS和Akt的磷酸化的增强。此外,Wortmannin的预处理也可以抑制STS引起的高温时HUVEC细胞中增加亚硝酸盐的含量。MK-2206预处理导致热诱导的HUVEC细胞凋亡比例的增加,这一情况无论是否加入STS都无法改变。MK-2206预处理导致热诱导的HUVEC细胞中裂解的caspase-3表达增高,这一情况同样不受STS的影响。结论:1.热应激可诱导HUVEC细胞凋亡,随着热诱导时间的延长凋亡率增加;2.适量的STS可以抑制热应激引起的HUVEC细胞凋亡;3.STS作用可以激活PI3K/Akt通路,使eNOS磷酸化增加,从而导致HUVEC在热应激状态下一氧化氮(NO)产生增多。STS可以通过PI3K/AKT/eNOS途径抑制热应激引起的HUVEC细胞凋亡。意义:本研究初步阐明了STS对热诱导HUVEC细胞凋亡影响的相关作用机制,同时也反映出HUVEC细胞针对高热做出的应答反应,为探寻热射病损伤内皮细胞机制提供了实验依据,也为辅助治疗提供了潜在作用靶点。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R594.12
【部分图文】：

是由于与高热引起的一些急性生理改变之间复杂的相互作用（例如，循环衰竭，??缺氧和代谢需求增加）而产生的，热的直接细胞毒作用，与宿主炎症和凝血反应。??这一系列事件导致微循环血流改变，导致血管内皮和组织损伤（如图１－１所示）。??５??

参酮ＩＩＡ磺酸钠预防血管内皮细胞凋亡的分子机制研究结?果??测热诱导不同时长ＨＵＶＥＣ细胞的相对ＨＵＶＥＣ细胞活性产生的影响，我们用ＣＣＫ－８活露不同时间的ＨＵＶＥＣ细胞活性。ＨＵＶＥＣ细胞在４、０．５小时、１小时、１．５小时、２小时、２．５小时、３检测细胞活性随着时间的延迟而减少（图２－１）。??－

２－２－１ＨＵＶＥＣ、（Ｃ）、（Ｄ）分别表示热诱导０小时、１小时、２小时、４小时后Ａｎｎｅｘｉｎ?ＨＵＶＥＣ细胞的凋亡率。??１００－１??ｇ?一??ｗ?８０－?丁??ａ?？??＞?６０－??Ｉ?丁??＾?４０－?？??０?－Ｉ—??〇?２０．??Ｓ：??〇－＊—Ｉ?．?．??＾?＾?＾??Ｈｅａｔ?Ｔｒｅａｔｅｄ?Ｔｉｍｅ??图２－２－１热诱导不同时间点ＨＵＶＥＣ细胞凋亡率统计??
【参考文献】

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本文编号：2850112