VWF-A2对创伤性脑损伤神经保护作用及机制研究

发布时间：2020-11-01 05:32

　　 背景和目的:创伤性脑损伤(Traumatic brian injury,TBI)是威胁人类生命的重大疾病,具有高致残、致死特点,目前尚缺乏有效的药物干预手段。TBI病理生理机制复杂,继发的凝血功能障碍(TBI associated coagulopathy,TBI-AC)及血脑屏障破坏被认为与其不良预后相关。前期研究发现,TBI急性期粘附配体血管性血友病因子(von Willibrand factor,VWF)水平升高且粘附活性增强,通过与脑源性微囊泡(brain-derived microvesicles,BDMVs)结合,协助BDMVs破坏血脑屏障及引起TBI-AC。有研究证明纯化的VWF-A2片段可抑制血小板与VWF以及血小板与纤维蛋白的相互作用。本研究拟通过重组质粒转染、表达、纯化获得高纯度重组VWF-A2蛋白,腹腔注射干预TBI小鼠。探索VWF-A2对TBI小鼠血脑屏障及凝血系统的影响,同时探索其可能的作用机制,为TBI患者药物治疗提供新思路。方法:(1)通过重组质粒转染、表达、纯化获得重组VWF-A2蛋白(组氨酸标签标记)。通过凝胶电泳、蛋白质印迹法及金属酶ADAMTS-13体外酶切实验对VWF-A2进行鉴定和初步功能性研究。(2)通过液压打击仪制备C57BL/6J小鼠重型TBI模型,伤后30 min腹腔注射VWF-A2(4 mg/kg),检测不同时间点VWF-A2循环血浓度。评估VWF-A2对TBI小鼠伤后3天内死亡率的影响,改良版神经功能评分评估神经功能预后。(3)伊文氏蓝渗漏实验检测TBI小鼠血脑屏障通透性。苏木精-伊红染色评估TBI小鼠肺组织血管渗出情况。流式细胞术检测循环血MVs水平。Transwell小室系统和免疫荧光染色技术检测VWF-A2对TBI小鼠外周血源性MVs及体外冻融匀浆法制备的BDMVs介导的内皮屏障破坏的影响。(4)酶联免疫吸附试验检测TBI小鼠循环血VWF抗原、D-二聚体和纤维蛋白原含量及VWF结合胶原能力。磷钨酸-苏木精染色评估TBI小鼠肾脏纤维素沉积情况。凝血酶生成实验和活化凝血因子X凝血时间检测MVs介导的凝血反应。流式细胞仪和血细胞计数仪检测血小板激活水平及血小板计数。小鼠断尾流血时间检测TBI小鼠出血倾向。(5)免疫共沉淀法及表面等离子体共振技术检测TBI小鼠循环血及体外VWF与VWF-A2相互作用。同时评估VWF-A2对瑞斯托霉素辅因子活性和剪切力诱导的血小板聚集的影响。结果:通过VWF-A2重组质粒转染、表达、纯化成功获得大量高纯度重组VWF-A2蛋白(纯度90-95%),金属酶ADAMTS-13可有效酶切VWF-A2,证明了其具有生物学活性。VWF-A2可减少TBI后循环血中携带VWF的脑源性、血小板源性及内皮细胞源性MVs释放,抑制VWF协助下BDMVs介导的血脑屏障破坏及内皮细胞激活,同时降低了TBI小鼠死亡率,改善存活小鼠神经功能预后。同时,VWF-A2可减少TBI后高活性VWF的释放并能抑制其粘附活性,减轻VWF引起的血小板激活及血小板减少症。此外,VWF-A2对凝血及纤溶级联反应也有抑制作用,表现为减轻了MVs介导的凝血酶生成及活化凝血因子Xa凝血反应,D-dimer水平下降,纤维蛋白原水平上升,并且缓解了TBI后出血倾向但不引起正常老鼠出血倾向。最后,通过体内、体外实验证实VWF-A2可结合到活化VWF暴露的A1结构域,抑制其活性,表现为减轻瑞斯托霉素或剪切力诱导的血小板聚集。结论:本研究成功纯化重组VWF-A2蛋白,证明VWF-A2可减轻TBI小鼠血脑屏障及凝血系统损害,降低死亡率,改善神经功能预后。其神经保护机制可能是结合并抑制了TBI后释放的高活性VWF功能,提示了其作为药物开发的可行性,为TBI药物治疗提供新思路。同时,VWF-A2还可能成为特异性检测高活性VWF的新手段,用于诊断血栓性血小板减少性紫癜、严重感染等疾病。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R651.15
【部分图文】：

MVs 经鼠尾静脉注入正常 C57BL/6J 小鼠，小鼠表现出与遭受 TBI状态。同时，血脑屏障及肺组织微血管完整性均遭到了破坏，随实 BDMVs 可在血小板协助下介导内皮细胞激活和内皮屏障的破坏等[13]通过乳凝集素（Lactadherin，LAC）清除 TBI 小鼠循环血 MI 后血脑屏障破坏和高凝血状态得到了明显改善。Wu 等[14]研究发友病因子（von Willibrand factor，VWF）在 TBI 后大量释放，其粘并能与 BDMVs 结合，协助 BDMVs 引起内皮损伤和 TBI-AC。综图见图 1）：VWF 协助 BDMVs 破坏血脑屏障，进入外周同时激活细胞，并产生血小板和内皮细胞来源的 MVs，这些 MVs 同样携带表面 TF 可启动外源性凝血途径，进而启动内源性凝血途径，而 PS应提供了磷脂表面，加上 TBI 后结合到 MVs 上的 VWF，这使循大量的移动“凝血平台”，造成系统性高凝状态，并迅速进展为消。这就解释了单纯 TBI 造成的局部损伤是如何播散而引发早期全和高纤溶状态的。

后在高尔基体中通过 N 端二硫键形成多聚体。在糖基化和裂解去成熟 VWF[16-18]。多数 VWF 在正常生理情况下释放入血，少数胞的 Weibel-Palade 颗粒和血小板的 α-颗粒中，形成具有高度促血超大 VWF（Ultralarge VWF, ULVWF），分子量 500-20000 kDa，在内皮细胞或血小板释放[19, 20]。循环血中 VWF 折叠成球形，仅 V暴露便于与胶原结合。而与之相反，VWF-A1 和 VWF-A2 结构域球形结构中，避免生理情况下捕获、激活血小板（GPIbα-VWF-A ADAMTS-13（a disintegrin and metalloprotease with thrombospond 13）切割（VWF-A2 结构域内 Tyr1605-Met160 间肽键）[21, 22]。，ULVWF 释放入血，形成螺旋状长链结构通过 VWF-A3 结构域锚原，此时 VWF-A1 与 VWF-A2 的结合被打破，暴露功能位点：V血小板粘附、激活及聚集，而 VWF-A2 则可被金属酶 ADAMTS-1过度的促血栓形成活动。生理状态下，ULVWF 的分泌与裂解处于，当 VWF 异常增多或 ADAMTS-13 减少时，机体易发生凝血功能紊]。

1.1.1A：LB 固态培养皿，内含单个细菌菌落。B：灭菌枪头挑取单个菌中振荡培养。C：超声破碎后菌液。 将上述 2 mL 菌液置于 1 LLB 选择培养基（含抗生素）中，继续m/s 振荡培养数小时。 取 1mL 菌液于酶标仪专用检测管中，600 nm 波长处检测吸光度（如达不到，则继续培养。根据经验，培养 6 h 后可达到目标吸光度4 VWF-A2 蛋白诱导表达吸光度达标后，向 1 L 菌液中加入终浓度为 0.5mM 的 IPTG，于 4 振荡培养箱中培养 72 h 以诱导目标蛋白 VWF-A2 的表达。5 冰浴超声破菌 72 h 后，将菌液置于 400 mL 离心瓶中 4 ℃下 6000 rpm 离心 10 m25 mLPBS 缓冲液（pH 7.4）重悬菌体并转移至铝制超声破碎瓶中超声破碎，超声破碎仪参数为：恒定功率 300 W，工作 3 s，间隔 。超声破碎时应注意探头不能触碰铝瓶瓶底或侧壁，以免损坏机器
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本文编号：2865088