亚低温对急性呼吸窘迫综合征大鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体4蛋白及下游促炎介质的影响

发布时间：2020-11-01 09:20

　　 目的:本研究旨在:1.分析比较脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)大鼠肺泡灌洗液(Broncho Alveolar Lavage Fluid,BALF)、脾脏及外周血3种不同来源的巨噬细胞原代提取及培养方法。2、探讨亚低温(Mild Hypothermia,MHT)处理对LPS诱导的ARDS大鼠肺泡巨噬细胞(Alveolar Macrophage,AM)Toll样受体4蛋白及下游促炎介质的影响。研究方法:1、采用密度梯度离心法提取LPS诱导的ARDS SD(Sprang-Daley)大鼠BALF、脾脏及外周血中的原代巨噬细胞,通过免疫化学染色的方法对提取细胞进行鉴定、计数及纯度计算,并采用细胞增殖活性检测(Cell Counting Kit-8,CCK-8)试剂盒检测三种方法提取的原代巨噬细胞活性。2、分析亚低温处理对经LPS诱导的ARDS大鼠AM TLR4蛋白及下游促炎介质的影响。通过建立大鼠ARDS模型,分析相关TLR4、My D88、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factors-α,TNF-α)及诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)的变化。分别在原代巨噬细胞中加入浓度为0ug/ml,1ug/ml,5ug/ml,8ug/ml,10ug/ml,15ug/ml的LPS,通过CCK-8试剂盒对LPS干预原代巨噬细胞进行最适浓度梯度测定后,使用完全培养基,在温度37℃,体积分数5%CO2、湿度95%的培养箱培养原代巨噬细胞24h后,随机将细胞分为亚低温组和常温(Normothermia,NT)组,分别置于32℃和37℃的CO2培养箱中培养,每组再随机分为LPS干预组和磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)对照组;LPS干预组加入5g/ml LPS进行干预,对照组加入等量PBS。分别在培养0h、1h、4h、8h、16h及24h提取巨噬细胞RNA,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测巨噬细胞TNF-α和i NOS m RNA表达变化;并提取巨噬细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)检测巨噬细胞培养上清液中TNF-α和i NOS的表达变化;在培养1h、4h、8h、16h及24h提取巨噬细胞总蛋白,采用蛋白质免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测巨噬细胞TLR4和My D88蛋白的表达变化。结果:1.肺泡灌洗液、脾脏及外周血三种方法提取的原代巨噬细胞个数均值分别为(1.14±0.14)×106个、(9.29±0.19)×106个及(3.17±0.13)×106个,三组间两两比较差异有显著性意义(P0.05);三种方法提取的原代巨噬细胞的活性比较,肺泡灌洗液提取出的巨噬细胞显著高于另2组(P0.05),而脾脏与外周血提取的原代巨噬细胞差异无显著性意义(P0.05);三种方法提取的原代巨噬细胞通过免疫化学检测,得出细胞纯度分别为(95.779±1.170)%,(94.132±1.412)%,(94.012±0.954)%,差别无统计学意义(P0.05)。2.通过CCK-8试剂盒对LPS干预原代巨噬细胞进行最适浓度梯度测定后,得出最适LPS浓度为5ug/ml。3.巨噬细胞TLR4及My D88蛋白的表达:与常温组比较,TLR4蛋白表达量于亚低温干预后4h、8h、16h、24h明显下降(4h:0.376±0.011比0.262±0.032,8h:0.588±0.040比0.390±0.029;16h:0.767±0.013比0.555±0.050,24h:0.493±0.026比0.317±0.031,均P0.05);My D88蛋白于亚低温干预后1h、4h、8h、16h明显下降(1h:0.433±0.016比0.240±0.034,4h:0.524±0.026比0.351±0.020,8h:0.636±0.034比0.395±0.011;16h:0.726±0.008比0.568±0.023,均P0.05)。4.巨噬细胞TNF-αm RNA、i NOS m RNA表达(2﹣△△Ct):与常温组比较,亚低温组TNF-αm RNA及i NOS m RNA表达于干预后1h、4 h、8 h、16 h和24 h明显下降(TNF-αm RNA:1h:0.802±0.244ng/L比0.366±0.074ng/L,4h:1.644±0.157ng/L比0.771±0.121ng/L,8 h:3.213±0.857ng/L比2.007±0.690ng/L,16 h:7.916±2.292ng/L比3.944±0.447ng/L,24 h:4.116±1.340ng/L比2.517±1.165ng/L;i NOSm RNA:1h:0.679±0.147ng/L比0.366±0.129ng/L,4h:1.170±0.148ng/L比0.797±0.101ng/L,8 h:2.403±0.307ng/L比1.193±0.097ng/L,16 h:4.986±1.131ng/L比3.252±0.768ng/L,24 h:8.867±1.395ng/L比4.529±1.395ng/L,均P0.05)。5.巨噬细胞培养上清液TNF-α、i NOS炎症介质的表达:与常温组比较,亚低温组TNF-α表达于干预后4 h、8 h、16 h和24 h明显下降、i NOS表达于干预后1h、4 h、8 h、16 h和24 h明显下降(TNF-α:4h:128.859±23.667ng/L比48.784±7.627ng/L,8 h:214.136±14.460ng/L比110.594±5.957ng/L,16 h:390.949±5.789ng/L比216.305±11.229ng/L,24 h:600.659±9.415ng/L比348.981±15.844ng/L;i NOS m RNA:1h:84.297±0.582ng/L比64.798±5.479ng/L,4h:134.043±6.205ng/L比71.458±3.866ng/L,8 h:285.510±69.423ng/L比133.124±34.114ng/L,16 h:737.387±160.174ng/L比304.097±51.948ng/L,24 h:431.907±42.335ng/L比237.965±8.985ng/L,均P0.05)。结论:1、三种方法提取的原代巨噬细胞相较,巨噬细胞纯度差别无统计学意义,肺泡灌洗液提取的原代巨噬细胞活性最强,脾脏提取的原代巨噬细胞数量最多,外周血提取的原代巨噬细胞活性及数量介于两者之间。2、亚低温下调LPS诱导ARDS大鼠肺泡灌洗液巨噬细胞TLR4/My D88信号通路,从而抑制炎症介质的转录及表达。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R563.8
【部分图文】：

and DAPI nuclear staining（10×）4. CCK-8检测细胞活性CCK-8检测细胞活性结果表明（表1-1，图1-3），3组所获取的原代细胞活性比较，4个时间点的肺泡灌洗液提取的原代巨噬细胞检测出的吸光度值均显著高于其他2个培养组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，肺泡灌洗液提取的原代巨噬细胞活性最高，脾脏组织及外周血提取出的原代巨噬细胞活性差别在1 h与1.5 h无显著性意义(P > 0.05)，在0.5 h与2 h组差异均有显著性意义(P <0.05)；3个培养组与空白组之间两两比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。

浓度（ug/ml）时间（h）0.5 1 1.5 20 0.127±0.006 0.345±0.025a0.392±0.017a0.558±0.031 0.350±0.027a0.446±0.014a0.425±0.040a0.608±0.005 0.460±0.022a0.507±0.048a0.798±0.059ab1.066±0.058 0.462±0.032a0.512±0.048a0.705±0.131a1.020±0.0110 0.322±0.014a0.383±0.062a0.417±0.009a0.771±0.0215 0.200±0.077 0.250±0.041 0.380±0.037a0.764±0.03空白对照组 0.141±0.021 0.197±0.017 0.212±0.016 0.264±0.0F 63.634 37.211 47.956 284.67P 0.000 0.000 0.000 0.000表注：与空白对照组相比，aP<0.05； 5ug/ml、8ug/ml 两组间相比bP <0.05；LPS 浓度为 5ug/ml、8ug/ml 两组的 OD 值与其他组相同时间相比差别均有统计学差异（P <0.05）;而在其他相同时间差别无统计学意义（P >0.05）。H

低温对急性呼吸性窘迫综合征大鼠肺泡巨噬细胞 Toll 样受体 4 蛋白及下游促炎介质的影响 2019 届硕士学位论文结 果1. RT-PCR 检测巨噬细胞中 TNF- （图 2-2；表 2-7）和 iNOS（图 2表 2-8）的 mRNA 表达首先进行 PCR 反应检测 iNOS 及 TNF- 电泳扩增片段（图 2-1）。亚对照组和常温对照组中 TNF- 及 iNOS 的 mRNA 表达没有显著变化，亚干预组和常温干预组首先随时间变化逐渐增加，16h 达高峰，然后逐渐下预组 1h 后亚低温组 TNF- 和 iNOS mRNA 表达明显低于常温组（P <0.0低温组 TNF- 和 iNOSmRNA 表达水平显着低于常温组（P <0.05）。
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本文编号：2865331