还原型谷胱甘肽对骨髓间充质干细胞治疗急性肺损伤的影响

发布时间：2020-11-04 09:57

　　 背景:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是临床工作中常见严重呼吸系统疾病,发展快,病死率高。ARDS患者常表现为呼吸困难和顽固的低氧血症。尽管急性肺损伤在临床上日益受到重视,但是目前仍缺乏有效的治疗手段,寻找一个更加有效的新治疗方法迫在眉睫。随着人们对间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)研究的不断深入,发现其作为成体干细胞,具有强大的增殖能力、多向分化潜能以及免疫调节功能,可作为理想的种子细胞修复组织器官损伤,有研究表明其对ALI和ARDS的治疗具有一定的临床应用价值,可能是一种潜在的、有前景的新治疗方法。但是,肺损伤微环境中的高氧化应激状态很大程度上严重制约着外源MSC的修复功能。肺损伤微环境中可产生大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),移殖的MSC很容易暴露在高活性氧自由基环境中,从而过早的出现凋亡使定植于肺部的MSC数量减少,极大地影响了 MSC治疗急性肺损伤的疗效,因此,如何改善移植后微环境,提高移植细胞的存活率是目前MSC治疗ALI/ARDS所要面临的重要课题。还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)在线粒体氧化还原反应中扮演核心角色。GSH是细胞内的主要抗氧化物,近年来有大量研究表明GSH可以有效的治疗器官的氧化应激损伤,且已应用于临床。本课题基于MSC治疗肺损伤,但是在肺部高氧化应激状态下,MSC容易出现过早凋亡,所以研究GSH能否有效提高MSC的肺部定植率,使其在肺损伤高氧化应激微环境中发挥更好的治疗作用有重要意义。目的:探究还原型谷胱甘肽对大鼠骨髓间充质干细胞的氧化应激保护作用及其对间充质干细胞治疗急性肺损伤的影响。方法:1、大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定:分离大鼠股骨及胫骨骨髓腔内细胞,使用细胞贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并应用流式细胞术检测技术鉴定细胞表面标记物,应用成脂及成骨诱导培养基培养鉴定MSC的多项分化潜能。2、观察谷胱甘肽对高氧化应激环境中MSC的影响:利用过氧化氢(1mmol/L)制作高氧化应激损伤模型,使用还原性谷胱甘肽(5mmol/L)制作抗氧化模型。流式法观察细胞凋亡率及细胞内ROS水平,蛋白免疫印迹(Western blot)测定细胞bcl-1、p53、p-jnk蛋白表达情况。3、肺损伤模型的建立和MSCs肺内示踪:利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)经鼠尾静脉注射建立大鼠ALI模型,再经鼠尾静脉注射染色剂标记的MSCs。在MSCs注射后的15min,2h,24hand 72h几个时间点分别麻醉并处死大鼠,取出肺组织,利用小动物成像仪分析MSCs在大鼠肺内的留存情况,了解MSCs在大鼠肺内的分布。4、病理评价及肺湿/干重比:各组大鼠处理后获取全肺组织,左侧肺叶制作石蜡切片并HE染色,右侧肺叶测湿/干重。5、统计学分析:本试验数据均为计量资料,所有数据表达为X±SD,采用SPSS13.0分析软件。单组计量资料采用t检验;3组以上独立样本采用单因素方差分析(One-way ANOVA),重复测量资料采用重复测量数据的方差分析,P值小于0.05认为差异有统计学意义。结果:1、大鼠骨髓间充质干细胞在培养皿呈贴壁生长。CD29,CD44,CD90和CD105在细胞中呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。成骨成脂诱导培养基培养后染色可见脂肪小滴及骨组织。2、过氧化氢对骨髓间充质干细胞处理后,细胞存活率下降,凋亡率升高,细胞内ROS水平升高,p53、p-jnk蛋白表达水平上升,bcl-1蛋白表达水平下降;而谷胱甘肽组的细胞存活率上升,凋亡率降低,细胞内ROS水平下降,p53、p-jnk蛋白表达水平下降且bcl-1蛋白表达水平提高。3、染色标记的MSCs经鼠尾静脉注入大鼠体内后,可观察到注射后15min时肺内有大量的MSCs存留,随后MSCs在肺内逐步减少,72h肺内依然有少量MSCs留存。GSH处理后的MSC在注射后的2h、24h两个时间点内肺部定植率明显高于对照组。4、大鼠尾静脉注射LPS后,病理结果提示肺泡内炎性细胞浸润和肺泡间隔增厚。注射MSCs后肺泡炎性渗出液减少和肺泡间隔变窄。肺组织湿/干重比在大鼠注入LPS后升高,在尾静脉注入MSCs后湿/干重下降。GSH组的湿/干重比与对照组相比虽然数值较低但无统计学差异。结论:1、过氧化氢可导致骨髓间充质干细胞氧化应激损伤,还原性谷胱甘肽能有效减少细胞内ROS水平,并且通过影响相关蛋白的表达从而起到减少细胞凋亡的作用,具有氧化应激保护机制2、GSH处理后的MSC在注射后的2h、24h两个时间点在肺部定植率明显高于对照组,说明GSH在体内也可明显减少MSC的凋亡。3、MSC对LPS介导的大鼠急性肺损伤有明显的治疗效果。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R563.8
【部分图文】：

图１．．分离培养早期可见细胞团出现，细胞呈放射样生长，传代后可见成熟的梭型大鼠骨髓充质干细胞密集生长。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．?Ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｍａｓｓ?ａｐｐｅａｒｅｄ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｅａｒｌｙ?ｓｔａｇｅ，?ｗｅ?ｃａｎ?ｏｂｓｅｒｖｅ?ｍａｔｕｒｅ?ｓｐｉｎｄｌｅ?ｂｏｎｅ?ｍａｒｒｏｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ?ｔｈａｔ?ｗｅｌｌ?ｇｒｏｗｉｎｇ．??２．２大鼠骨髓间充质干细胞的成脂及成骨分化??将第四代生长情况良好的ＭＳＣｓ放入成骨及成脂诱导培养基中诱导培养，??按上文方法定期换液。成骨诱导１４天后用甲醛固定，茜素红染色后发现细胞出现红染的不规则钙化组织（图２Ａ）。成脂诱导１７天后，用甲醛固定，油红溶液染色，显微镜下观察细胞中出现红染的圆形脂肪小滴（图２Ｂ）??

将第四代生长情况良好的ＭＳＣｓ放入成骨及成脂诱导培养基中诱导培养，??按上文方法定期换液。成骨诱导１４天后用甲醛固定，茜素红染色后发现细胞中??出现红染的不规则钙化组织（图２Ａ）。成脂诱导１７天后，用甲醛固定，油红０??溶液染色，显微镜下观察细胞中出现红染的圆形脂肪小滴（图２Ｂ）??１４??

将大鼠骨髓间充质干细胞按上述方法经ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、??ＣＤ９０、ＣＤ１０５等抗体孵育后，放入流式细胞仪中测试，发现ＣＤ２９，?ＣＤ４４，?ＣＤ９０??和ＣＤ１０５抗体呈高表达，而ＣＤ４５，ＣＤ３４抗体呈低表达（图３）。??１５??
【参考文献】

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本文编号：2869952