负载穿心莲内酯的生物伪装磁性纳米载体用于内毒素血症治疗的研究

发布时间：2020-11-07 16:32

　　 内毒素血症是现代临床医学中所面临的一个常见而复杂的难题。其发病机制一般为病灶部位的革兰氏阴性菌被杀灭或凋亡后,细胞壁上的内毒素被释放出来进入血液系统而引发机体炎症反应和微循环障碍等一系列症状。细菌内毒素的分子结构为脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),其结构的稳定性使得常规除菌方法无法去除内毒素,目前针对内毒素血症的治疗大多集中在改善或对抗内毒素所引起的炎症反应,微循环障碍等的对症治疗。内毒素致病作用的分子机制一般被认为是LPS与机体内巨噬细胞或单核细胞等免疫细胞表面的LPS受体蛋白结合,刺激免疫细胞的炎症反应通道,继而产生大量的炎症因子,在大量的LPS刺激下,机体爆发“瀑布式”的炎症反应综合症,导致一系列的临床症状。针对这一机制,本实验设计通过提取巨噬细胞膜,将其包裹在Fe_3O_4纳米粒子表面,形成一种核-壳型的生物仿生型纳米载药系统Fe_3O_4@MMs,由于继承了巨噬细胞膜的表面性质,Fe_3O_4@MMs可以在体内外特异性地结合LPS分子,使LPS分子失去毒性作用,从而清除LPS分子。此外Fe_3O_4作为提供稳定性的基质外还可以适用于磁靶向治疗。最后,在Fe_3O_4@MMs对LPS分子清除作用的基础上,我们将抗炎药物穿心莲内酯(andrographolide,AD)负载于细胞膜疏水层中,构成Fe_3O_4@MMs@AD载药系统。当载药系统清除LPS时,由于LPS对膜层的插膜作用,使得药物快速释放出来,达到联合治疗内毒素所致炎症的目的。第二章,采用水热法制备正电荷的Fe_3O_4,差速离心法提取巨噬细胞膜,利用静电作用促进Fe_3O_4与细胞膜的融合,且通过脂质体挤出仪共挤出制备Fe_3O_4@MMs。并通过负载游离AD构建了Fe_3O_4@MMs@AD载药系统。电镜和粒径表征显示膜包被的纳米载药系统Fe_3O_4@MMs的构建成功,具有明显的核-壳型结构,粒径大小约为110 nm,表面电位与细胞膜电位相同,为-18 mV左右。AD的负载考察显示,投药量为10%、反应温度为37℃时,AD包封率和载药量最大,分别为84%和7.2%。体外释放研究表明当LPS存在时,可促进药物的快速定位释放。第三章,通过体外实验来验证纳米载药系统的生物安全性和药效作用。体外细胞毒性实验显示Fe_3O_4@MMs载体无细胞毒性,具有良好的生物相容性。体外吸附实验结果表明,在37℃下反应90 min,Fe_3O_4@MMs能有效降低溶液体系中的LPS浓度。通过细胞实验验证了游离AD、Fe_3O_4@MMs载体以及Fe_3O_4@MMs@AD联合治疗对LPS的解毒作用。细胞实验结果显示Fe_3O_4@MMs能有效抑制LPS所致细胞死亡率,减少细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,且Fe_3O_4@MMs@AD联合治疗效果更显著。第四章,构建内毒素血症小鼠模型,确定LPS的注射剂量。动物实验结果显示,通过Fe_3O_4@MMs@AD的治疗,内毒素小鼠血清炎症因子白介素6(interleukin 6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)等水平能有效降低,丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)浓度接近正常水平,体内实验表明Fe_3O_4@MMs@AD联合治疗组的治疗效果要优于AD和Fe_3O_4@MMs单独治疗。组织分布研究表明Fe_3O_4@MMs主要富集于肝、肺组织。肝、肺组织切片结果表明Fe_3O_4@MMs@AD组小鼠的组织损伤明显好转。且小鼠死亡率能有效降低。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R459.7
【部分图文】：

素的研究进展内毒素概述素（endotoxin）是革兰氏阴性菌细胞壁最外层的一种脂ysaccharide，LPS） ，是由 O-特异性多糖链、核心多糖和类脂部分所组成，其分子结构如图 1.1 所示。其中多糖类成分会随类的不同而有所差异，但在所有的细菌类毒素中，类脂 A 在不变，是内毒素的毒性活性中心和生物功能区[2]。内毒素分子有在细菌死亡或者人工破坏细菌细胞结构时才会释放出来。微入机体即会产生高热、寒冷、炎性反应、白细胞减少、低血压血以及致死性休克等症状。在临床上,由革兰氏阴性菌感染所一直以来是医学界和生物学家们所面临的一大难题[3]。

负载穿心莲内酯的生物伪装磁性纳米载体用于内毒素血症治疗的研究外科手术、烧伤、爆发性肝炎等多种应激情况下，肠粘膜屏障功能受损膜缺血、萎缩、破损、脱落等。而肠道作为最大的细菌及内毒素储存库障碍将导致大量细菌或内毒素移位进入体循环[14]（见图 1.2），内毒素包括：①经门静脉、肝脏进入体循环；②穿过肠粘膜屏障进入腹腔进而血循环；③经肠道淋巴管直接进入淋巴系统。由肠道、呼吸道内革兰氏的内毒素移位进入体循环所引起的内毒素血症，称为内源性内毒素血症创伤、烧伤创面等外伤感染以及输入被内毒素污染的液体制品进入体循致的内毒素血症，称为外源性内毒素血症。

图 1.3 红细胞膜“纳米海绵”示意图Fig.1.3 Diagram of erythrocyte membrane “nanosponge”纳米海绵技术可以通过与其他生物医学平台的集成而得到进一步的改进。在Janus 微粒或合成马达上包裹红细胞膜，可以改善诱饵膜与 PFT 之间的相互作用，这对于血液或体液内的生物解毒有很大的作用[63][64]。反之，红细胞膜纳米粒子包封于水凝胶中可以将解毒颗粒定位到细菌聚集区和毒素释放区域，例如定位在MRSA 引起的皮肤损伤附近。改进后的纳米多孔膜的定位和缓释性能可以协同作用，提高抗菌效果[65]。红细胞膜的外毒素吸收特性在多种抗生素联合应用系统中也有一定的应用价值。红细胞膜包裹的明胶颗粒被用于吸收六种不同细菌释放的不同类型的外毒素，大大减少了多种情况下的溶血。在保护了体内的健康红细胞之后，纳米粒子在明胶酶阳性细菌的存在下降解，并释放负载的万古霉素杀死细菌[66]。
【参考文献】

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本文编号：2874199